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小鼠血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中C肽實驗心得
閱讀：1522 發(fā)布時間：2013-6-20小鼠血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中C肽實驗心得
實驗心得一：實驗步驟
1. 準備：從冰箱取出試劑盒,，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。
2. 配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3. 加標(biāo)準品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板,，固定于框架上,，分別設(shè)置標(biāo)準品孔、待測樣本孔和空白對照孔,，記錄各孔位置,，在標(biāo)準品孔中加入標(biāo)準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）,；空白對照孔不加。
4. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min,。
5. 洗板：棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）,。
6. 加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對照孔不加,。
7. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min,。
8. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL,，再加入顯色劑B液 50μL,，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min,。
10. 終止：取出酶標(biāo)板,，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測定：以空白孔調(diào)零,，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）,。
12. 計算：根據(jù)標(biāo)準品的濃度及對應(yīng)的OD值,，計算出標(biāo)準曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù),。
實驗心得二：注意事項
1. 樣本不能含疊氮鈉（NaN3）,，因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。
2. 標(biāo)本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能立即試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 樣本應(yīng)充分離心,，不得有溶血及顆粒,。
4. 實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準,。
5. 酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
6. 建議所有的標(biāo)準品,、樣本和空白對照都做雙份檢測,，取平均值，以減小實驗誤差,。
7. 牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍,，計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
8. 本試劑盒定量范圍為62.5-2000pg/mL,，超過此范圍,，為標(biāo)準曲線延伸計算所得，不做為準確定量結(jié)果,，請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結(jié)果（62.5-2000pg/mL范圍內(nèi)）,，乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。
9. 若顯色過淺,，可適當(dāng)延長底物溫育時間,。
10. 為避免交叉污染，標(biāo)準品,、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭,；酶標(biāo)工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分,，要懸臂加樣,，不得碰到微孔,；不得重復(fù)使用封板膜。
11. 試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用,，不同批號的試劑不得混用,。
12. 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下,。
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