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酶標(biāo)記抗體的制備方法檢測分析
閱讀：1903 發(fā)布時(shí)間：2013-4-9
ELISA試劑盒酶標(biāo)記抗體的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
?。?）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑,，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記,。交聯(lián)方法一步法,、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體,。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便,、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格,，結(jié)合物的大小也不均一,，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),，影響效果,。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用,，透析除去多余的戊二醛后,，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用,，再與酶聯(lián)結(jié),。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度,，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低,。
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí),，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié),，其*比例為：酶/抗體=1-2/1,。此法簡便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法,，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈,，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體,。理論上,，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過*洗滌,，游離酶可被除去,，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同,，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原,，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化,，去除游離的酶和抗體后用于檢測,，效果更好。純化的方法很多,，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用,。硫酸銨鹽析法zui為簡便，但效果并不理想,，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶,，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取,，液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶,、游離抗體和純結(jié)合物而取得*的分離效果，但費(fèi)用較貴,。
結(jié)合物制得后,，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^濃的結(jié)合物,，既不經(jīng)濟(jì),，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低,，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí),，能維護(hù)一個(gè)低的本底,，并獲得測定的*靈敏度，達(dá)到zui合適的測定條件和測定費(fèi)用的節(jié)省,。就酶標(biāo)抗體本身而言,，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽性反應(yīng)的zui高稀釋度,。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000,，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與大鼠elisa試劑盒,，小鼠elisa試劑盒,試劑盒價(jià)格，進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品,，標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格