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干擾素的實驗步驟及其注意事項
閱讀：3468 發(fā)布時間：2013-3-27實驗步驟
1. 制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株,，以雞胚尿囊液形式保存于-20℃,，
其血凝滴度穩(wěn)定在1:640～1:1 280之間。大量繁殖時，用0.5%水解乳蛋白稀釋100～1 000倍,，接種于9日齡雞胚尿囊腔,，置37℃培養(yǎng)72h后，收獲尿囊液,，效價測定應(yīng)大于1:640,，無菌檢查應(yīng)合格。
2. 制備誘生細(xì)胞：無菌采取人外周血（多用人臍帶血,，或血庫貯藏血）,，置于含肝素的無菌瓶內(nèi)，于4℃保存不超過24h,，誘生細(xì)胞（白細(xì)胞）不單獨提取,，以全血代替。
3. 制備粗制干擾素：
1） 加誘生劑,，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑（即NDVF系尿囊液,，其血凝滴度不低于1:640）；
2） 加溫吸附,，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h,，每隔15min晃動一次，使NDVF吸附于白細(xì)胞上,。然后以1000r/min離心20min,，棄上清，留沉淀物,；
3） 加營養(yǎng)液孵育誘生,，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養(yǎng)液于上述沉淀物中，混勻,，置35～36℃溫箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18～20h,；
4） 離心及酸處理，將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min,，取上清,，以6mol/L鹽酸將其pH值調(diào)至2.0，置4℃冰箱5天滅活NDV,；
5） 中性化,，經(jīng)5天酸化后，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.2～7.4,，即為粗制干擾素,。
4. 制備精品干擾素：
1） KCNS沉淀，取上述粗制干擾素,，加KCNS并用2mol/L HCl調(diào)pH值為3.5,，然后以2 000r/min離心30min取沉淀,；
2） 酒精提取，將沉淀溶于95%酒精（預(yù)冷至-20℃）,，用2mol/L NaOH調(diào)pH值為4.2,，以2 000r/min離心30min取上清；用2mol/L HCl調(diào)pH值至3.5,，離心后取上清,，再將pH值調(diào)至5.6，離心后取上清,，zui后將pH值調(diào)至7.1,，離心后取沉淀；
3） 過碘酸鈉沉淀,，將沉淀溶于PBS中,，加過碘酸鈉，并調(diào)pH值為4.5,，用50%乙醇10倍稀釋,，離心后取上清，將上清液對0.3mol/L （NH4 ）2 CO3 （pH值7.6）在4℃下透析過夜,。
4） sephacryl S200柱層析：將sephacryl S200按要求處理后裝柱（4～5×100cm柱）,，用PBS平衡后，加樣（即上述上清液）,，用洗液洗脫,。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測，收集相應(yīng)峰即為精制干擾素,。取樣進(jìn)行效價測定,，按結(jié)果進(jìn)行稀釋，分裝并凍干,。
5. 檢定
1） 效價測定
a. 制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒（VSV）在雞胚成纖維母細(xì)胞上傳代后,，
再在豬細(xì)胞（IBRS）上傳3～5代，使其對IBRS有良好致病效應(yīng),，其TCID50應(yīng)穩(wěn)定（一般在10-6 ～10-7 之間）。
b. 準(zhǔn)備測定細(xì)胞：生長良好的幼齡IBRS單層細(xì)胞,。
c. 測定：取上述單層細(xì)胞分為若干組,，每組加不同稀釋度的干擾素，置37℃孵育20～24h,，然后每管均用100個TCID50的VSV攻擊,，置37℃ 48～72h孵育后，觀察結(jié)果,。同時設(shè)細(xì)胞對照組和病毒對照組,。病毒對照組CPE＞75%,，正常細(xì)胞對照組CPE=0，即認(rèn)為該測定系統(tǒng)有效,。干擾素判定標(biāo)準(zhǔn)是以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位,。
2） 酸堿度測定
取本品10支，加水溶解,，精密測量pH值應(yīng)為6.0～7.5,。
3） 水分測定
按磺硫溶液法測定，不得超過3%,。
4） 安全試驗
取本品加水溶解,，小鼠尾靜脈注射，48h內(nèi)不得有死亡,。
5） 熱原檢查
取本品1支,，加水溶解，依法檢查,，應(yīng)符合規(guī)定,。
6） 菌檢
取本品3支，無菌水溶解,，分別接種到檢查需氧菌,、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周,，應(yīng)無菌生長,。
7） 超敏反應(yīng)
取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品適量,，連續(xù)3次,，于20天后再于耳靜泳注入本品適量，應(yīng)無過敏反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生,。
注意事項
1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時,，種毒應(yīng)無菌檢查合格，且滴度在1:640以上,。收毒時,，應(yīng)將污染的雞胚棄去。
2. 不必從血液中將白細(xì)胞提取出來,，因紅細(xì)胞對白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素有營養(yǎng)作用,。純化的白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素效價不一定高。
3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV,，而在pH值20時,，干擾素是穩(wěn)定的。
4. 在常溫下干擾素半衰期很短,。故各種操作要在低溫環(huán)境下進(jìn)行,，動作要迅速,，純化所用試劑要作預(yù)冷處理。干擾素粗品及精品要及時置低溫下存放,。效價測定時,，干擾素應(yīng)于臨用時現(xiàn)溶解。
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