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ELISA雙抗體夾心法及間接法的正確操作步驟
閱讀：6509 發(fā)布時間：2013-3-25ELISA雙抗體夾心法及間接法的正確操作步驟
elisa試劑盒原理
ELISA是以免疫學反應為基礎,，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物,，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性,。在實際應用中，通過不同的設計,，具體的方法步驟可有多種,。即:用于檢測抗體的間接法（圖a）、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法,。
操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,，4℃過夜,。次日，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次,，每次3分鐘。（簡稱洗滌,，下同）,。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時,。然后洗滌,。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）,。
3. 加酶標抗體：于各反應孔中,，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時,，洗滌,。
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘,。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml,。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強,，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”,、“-”號表示。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O?D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性,。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,，每孔加0.1ml,，4℃過夜。
2,、次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌,。同時做空白,、陰性及陽性孔對照于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml,，37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,zui后一遍用DDW（超純水）洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4,、5,、6。
3. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,，37℃10～30分鐘,。
4. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
5. 結(jié)果判定：可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺,，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”、“-”號表示,。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處,，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O?D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性,。
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