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分析影響ELISA中非特異性顯色的原因
閱讀：593 發(fā)布時間：2023-5-10影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,，如試劑盒特異性,、檢驗標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,，操作過程中的問題,。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,，從而提高檢測的特異性，并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實驗結(jié)果,。
試劑盒特異性因素
1. 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種,，以微量滴定板最為常見[1]。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高,，空白值低，各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此,，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認(rèn)證，評估,。
2.包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制,，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度,，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
3.包被抗體的效價,。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面,。
4 .封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
檢驗標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
1.內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子(RF),、黃疸等，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類,，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng)，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2 .外源性干擾物,，常常因樣品采集、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2]，有國內(nèi)報道酶免HAg試劑檢測溶血標(biāo)本時可造成假陽性[3],。如在冰箱中保存過久,，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此,，血標(biāo)本在采集處理時應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過久,。
標(biāo)本凝集不全時,，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性,。
操作過程中的問題造成假陽性
1.加樣
對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,，如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時,，很小的絕對誤差,，會導(dǎo)致較大的相對誤差，使陰性(或弱陽性)標(biāo)本呈陽性(或陰性),。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,，可較好地避免以上誤差,。
2.洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視,。無論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3 .溫育
每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式,，其中溫度和溫育時間控制是重要因素,。因孵育溫度高，反應(yīng)時間長,，會造成整板本底高,，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,。
4.酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確,，最好使用雙波長，一個檢測波長,，一個參比波長,，以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時最好先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書