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分析影響ELISA中非特異性顯色的原因
閱讀:593 發(fā)布時間:2023-5-10影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,,如試劑盒特異性,、檢驗標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,,操作過程中的問題,。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,,從而提高檢測的特異性,并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實驗結(jié)果,。
試劑盒特異性因素
1. 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種,,以微量滴定板最為常見[1]。它具有良好的吸附性能,,孔底透明度高,,空白值低,各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此,,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認(rèn)證,評估,。
2.包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制,,包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,,只能盡可能提高純度,,提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
3.包被抗體的效價,。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面,。
4 .封閉,。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],,減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
檢驗標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
1.內(nèi)源性干擾物:類風(fēng)濕因子(RF),、黃疸等,類風(fēng)濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,,多數(shù)為IgM類,,能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,,如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2 .外源性干擾物,,常常因樣品采集、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,,被細(xì)菌污染,標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本,,紅細(xì)胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,,以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2],有國內(nèi)報道酶免HAg試劑檢測溶血標(biāo)本時可造成假陽性[3],。如在冰箱中保存過久,,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此,,血標(biāo)本在采集處理時應(yīng)小心,在冰箱中保存不易過久,。
標(biāo)本凝集不全時,,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性,。
操作過程中的問題造成假陽性
1.加樣
對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,,如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差,尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時,,很小的絕對誤差,,會導(dǎo)致較大的相對誤差,使陰性(或弱陽性)標(biāo)本呈陽性(或陰性),。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,,不可產(chǎn)生氣泡,。目前,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,,可較好地避免以上誤差,。
2.洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,應(yīng)引起操作者重視,。無論是手工操作還是機(jī)器操作,,得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),,以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3 .溫育
每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式,,其中溫度和溫育時間控制是重要因素,。因孵育溫度高,反應(yīng)時間長,,會造成整板本底高,,陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,,反應(yīng)板不宜疊放,,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),,板上應(yīng)加蓋,。
4.酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器,酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,,決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),對濾光片要定期校正,;其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確,,最好使用雙波長,一個檢測波長,,一個參比波長,,以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外,在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時最好先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,,使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書