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酶法試劑盒操作步驟
閱讀：841 發(fā)布時(shí)間：2020-12-18一、實(shí)驗(yàn)原理
酶法試劑盒（ELISA）實(shí)驗(yàn)原理是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,，并保持其免疫活性,；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,，又保留酶的活性,。
二、操作步驟
1.ELISA在操作前試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,，標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品,，建議做復(fù)孔。按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液,。從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,，樣本孔加待測樣本50μL,，空白孔不加。除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
3.溫育好后揭開封板膜，棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置20s,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干。如此重復(fù)4次（共洗板5次）,。若使用自動(dòng)洗板機(jī),，請按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡20s的程序,，可以提高檢測的精度,。洗板結(jié)束，加底物前,，要在干凈不掉屑的紙上,，充分拍干反應(yīng)板。洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗,。
ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中,，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,，不得馬虎。
4.洗板好后將底物A和B按1:1體積充分混合,，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min,。所有孔加入終止液50μL,，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
5.檢測完成后,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl）,，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計(jì)算樣品的濃度值,。如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的終濃度。
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