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收到細胞株該如何處理,？
閱讀：1222 發(fā)布時間：2019-7-15 1.收到細胞，時間要鏡檢：觀察細胞形態(tài)是否正常,，對于貼壁細胞則要注意看貼壁情況是否很好,，觀察細胞密度，有疑議及時咨提供細胞的技術(shù)人員,。由于運輸?shù)臅r間或者溫度的變化,，很多貼壁細胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長的狀態(tài)和平時會有點不一樣，主要是貼壁牢固問題,。比如293T,，平時貼壁就不是很牢，在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面,，會發(fā)生大片的脫落,，細胞聚集在一起，但是細胞生長還是正常的,，通過離心收集,，加以胰酶的消化，重新打散,，又可以正常的貼壁生長,。
2.當(dāng)通過上一步的觀察，細胞初步?jīng)]有任何問題時,，進行下一步操作,。當(dāng)收到的細胞密達到80%左右時，則處理如下：棄除瓶中大部分培養(yǎng)基,，僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基,；或更換新鮮的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中,，隨后每天觀察,。細胞在低于正常生長溫度情況下，會調(diào)整為靜止期,，或者慢速生長期,，必須恢復(fù)37度的環(huán)境至少3個小時左右，才能重新調(diào)整到接近對數(shù)生長期的狀態(tài)，在對數(shù)生長期進行細胞的傳代會大大增加傳代的成功率,，和細胞的存活率,。
3.如果經(jīng)步觀察發(fā)現(xiàn)細胞密度超過90%，并且細胞狀態(tài)很好時,，則復(fù)溫后2個小時需要立即傳代,。傳代的比例應(yīng)依據(jù)不同的細胞而定。對于生長比較快,，狀態(tài)穩(wěn)定,，不易受外界影響的細胞可以一次多傳幾瓶；對于生長較慢,，細胞比較薄,，狀態(tài)容易波動的細胞類型，一次少傳些,，保證每瓶細胞密度大些,，便于穩(wěn)定生長。至于一些比較陌生的細胞,，次處理也可以依照第二種情況,。
傳代操作：
1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細胞,，稀釋多余的培養(yǎng)基,，之后吸走洗液，動作要輕,，不可吹打到細胞,。
3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,，以能覆滿瓶底為限,。
4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮,，細胞間隙增大后,，細胞變圓，比較松動后,，立即終止消化,。
5.加入該細胞對應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。
6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細胞,，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液,。吹打時應(yīng)盡量以少的次數(shù)將細胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度,、次數(shù),，還要注意要將細胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細胞，又能便于細胞再次均勻貼壁生長,。
7.依據(jù)傳代比例,，將細胞懸液分瓶，再補充培養(yǎng)基后,，靜置于溫箱培養(yǎng),，直止貼壁。
貼壁細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,，繼續(xù)生長的空間不足,，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積,，需要分瓶培養(yǎng),，對細胞進行傳代擴增。對于貼壁不太緊的細胞如293,，可以直接吹散后分瓶,。而對于貼壁較緊的細胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶,。以筆者的經(jīng)驗,，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對于經(jīng)驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的,。
胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度則對細胞的活性影響較大,，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下,，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性,。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件,、凍存或4℃保存時間長短,、是否反復(fù)凍融、解凍后存放時間及溫度等),、消化時的溫度(氣溫,、細胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強很多,，不同細胞對消化液的敏感性也不同,，比如HEP-G2人肝癌細胞，該細胞消化時間可長達10分鐘左右,。 消化時間仔細去摸索一下,，每過2分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄*消化時間,，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可,。
對于懸浮細胞換液時只需要補液就行,。
懸浮細胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過計數(shù)算好傳代的比例,，直接分瓶,，補液。有些懸浮細胞趨于成團生長,，此時細胞生長狀態(tài)良好,，當(dāng)補液時，避免吹打,。典型實例：jurkat就是成團生長,。當(dāng)jurkat細胞密度比較大時，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右,，待大部分細胞沉下,，吸走上層清液，補充等量的新鮮培養(yǎng)基,。而HL-60就不一樣了,，為懸浮單個生長，如果發(fā)現(xiàn)該細胞包團,，說明細胞狀態(tài)不好,，不加以正確的處理，終會發(fā)生凋亡,。
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