化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
酶標(biāo)記抗體的制備方法來襲,，您準(zhǔn)備好了么？
閱讀：1834 發(fā)布時(shí)間：2019-4-24一,、酶標(biāo)記抗體概述：
酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等,。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否,，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中*常用的是酶標(biāo)記抗體,，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成,。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體,，其次要有良好的制備方法,。目前，高質(zhì)量的酶（如辣根過氧化物酶,，簡(jiǎn)稱HRP）國內(nèi)已有商品供應(yīng),。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上,，宜選用產(chǎn)率高,、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。
二,、酶標(biāo)記抗體的制備方法
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法,。
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié),。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記,。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種,。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián),。它具有操作簡(jiǎn)便,、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的,，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格,，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶,，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),，影響效果。在兩步法中,，先將酶與戊二醛作用,，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體,。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié),。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的,，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低,。
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶,。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí),，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié),，其*佳比例為：酶/抗體=1-2/1,。此法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是HRP*可取的標(biāo)記方法,，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈,，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體,。理論上,，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中*后的酶活性測(cè)定,，因經(jīng)過*洗滌，游離酶可被除去,，并不影響*終的顯色,。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原,，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量,。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè),，效果更好,。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用,。硫酸銨鹽析法*為簡(jiǎn)便,，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶,，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開,。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶,、游離抗體和純結(jié)合物而取得*佳的分離效果,，但費(fèi)用較貴。
三,、酶標(biāo)記抗體結(jié)合方法
結(jié)合物制得后,，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^濃的結(jié)合物,，既不經(jīng)濟(jì),，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低,，則又影響檢測(cè)的敏感性,。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。*適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí),，能維護(hù)一個(gè)低的本底,，并獲得測(cè)定的*佳靈敏度，達(dá)到*合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省,。就酶標(biāo)抗體本身而言,，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽性反應(yīng)的稀釋度,。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000,，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽性反應(yīng),。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中,，酶標(biāo)抗體的*適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本,、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響,，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。