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ELISA酶結(jié)合物的制備的過程
閱讀：2936 發(fā)布時間：2017-12-11ELISA酶結(jié)合物的制備
免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic technique)又稱酶免疫測定法,是繼免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的又一種免疫標記技術(shù),。它是把抗原抗體的特異性反應(yīng)和酶的催化作用相結(jié)合而建立的。該技術(shù)通過化學(xué)方法將酶與抗體或抗抗體結(jié)合,，形成酶標記物,，這些酶標記物仍保持免疫學(xué)活性和酶的活性，然后將它與相應(yīng)的抗體或抗原起反應(yīng),，形成酶標記復(fù)合物,，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶，在遇到相應(yīng)的底物時,，則催化底物產(chǎn)生水解,、氧化或還原等反應(yīng)，而可溶性或不溶性有色物質(zhì),。然后根據(jù)顯色的深淺來反映待測樣品中抗原或抗體的含量,，如的有色物質(zhì)為可溶性，則可用肉眼比色或酶標測定儀測定光密度值(OD)定性或定量,；如的有色物質(zhì)為不溶性沉淀物,，同時又是電子致密物質(zhì)，則可用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡識別和定位,。因此,，免疫酶技術(shù)是一項定位、定性和定量(敏感度可達每毫升ng~pg水平)的綜合技術(shù),。常用的酶是辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP),。
酶結(jié)合物的制備
酶標抗體或抗抗體(抗免疫球蛋白)結(jié)合物可采用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法制備。郭春祥建立的辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行,，標記效果好,，特別適用于實驗室的小批量制備。現(xiàn)將操作方法介紹如下：
(一) 結(jié)合物的標記將5mg HRP溶于05ml蒸餾水中,，加入新配制的006mol/L NaIO4水溶液05ml,，混勻,，置冰箱30min，取出加入016mol/L乙醇水溶液05ml,，室溫放置30min后,，加入含5mg純化抗體的水溶液(或PBS)1ml，混勻并裝透析袋,，以005mol/L,、pH值95碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h(或過夜)使之結(jié)合，然后吸出加NaBH4溶液(5mg/ml)02ml,，置冰箱2h,。將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放置30min,，離心,，將所得沉淀物溶于少許002mol/L、pH值74 PBS中,，并對之透析過夜,。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結(jié)合物,。用002mol/L,、pH值74 PBS加至5ml，進行測定后,，冷凍干燥或低溫保存,。 酶結(jié)合物的制備
(二) 結(jié)合物中HRP與抗體量的測定酶標結(jié)合物于751型分光光度計上分別用280及403nm波長測定其光密度(OD)，并計算出OD403與OD280之比值以及HRP與抗體的mol/L比,。
結(jié)合物中HRP濃度(mg/ml)=OD403×04
結(jié)合物中IgG濃度(mg/ml)=(OD280-OD403×03)×062
酶/抗體mol/L比=HRP濃度IgG濃度×4
(三) 結(jié)合物稀釋度的測定
用酶結(jié)合物中抗體相應(yīng)的抗原直接包被聚苯乙烯反應(yīng)板，采用ELISA直接法測定酶結(jié)合物效價,。通常本法制備的酶結(jié)合物作1∶10 000稀釋時,，其OD403仍在01以上。
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