Western實(shí)驗(yàn)中,，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜”步驟,，從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行Western Blot的檢測和顯示,，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散,，轉(zhuǎn)膜要盡快進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜是對Westernzui終結(jié)果影響zui大的一步,，轉(zhuǎn)膜質(zhì)量的好壞直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞,。下面介紹一些實(shí)用技巧，趕緊Get起來吧,。
 

膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來考慮,，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的,，因?yàn)榭赡軙沟玫鞍滓蛲高^膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白含量不確定,，從而影響zui終結(jié)果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜,，而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜,。常見的膜有NC膜和PVDF膜，區(qū)別如下：

不同分子量的蛋白質(zhì)選擇的凝膠濃度和轉(zhuǎn)膜時間也是不同的，原則上高分子量蛋白用低濃度膠,，轉(zhuǎn)膜時間較長,，而低分子量蛋白用高濃度膠分離，采用較短的轉(zhuǎn)膜時間,，下表可供參考：

3. 轉(zhuǎn)膜操作注意事項(xiàng)

（1） 避免直接接觸膜,，全程戴手套并使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑,；

（2） PVDF膜具有疏水性,，使用之前需用甲醇浸泡；

（3） 排列三明治時,，盡量用干凈的玻璃棒或試管趕走膠和膜之間的氣泡,，避免轉(zhuǎn)膜不均勻,；

（4） 確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否則會導(dǎo)致電流不能通過膜,，從而轉(zhuǎn)膜無效,；

（5） 雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高背景,，故如果選擇雞來源的抗體,，使用硝酸纖維素膜（NC膜）,。

為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功,，可以用麗春紅進(jìn)行染色，將膜放入TBST洗一次,，然后置于麗春紅染色工作液中,，室溫下?lián)u動染色5分鐘，大量的水洗膜,，直至水變清無色,，蛋白條帶清晰。