化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA試劑盒實驗常見問題分析
閱讀：2184 發(fā)布時間：2016-9-8ELISA實驗常見問題分析
異常 | 結(jié)果描述 | 原因分析 | 對策 |
白板 | 顯色步驟結(jié)束后,，酶標板所有孔均無顏色,。陽性對照不顯色。 | 試劑已過效期,，或不同試劑盒組分混用 | 檢查試劑的組分及批號,，確認未過期以及所有組分均屬對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用,。 |
錯加,、漏加試劑底物、顯色劑A或B | 嚴格按說明書的步驟操作,，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致,，以減少漏加現(xiàn)象。 | ||
洗板及加樣過程中,，酶標受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等,，確認配制洗液的容器已洗干凈。 | ||
終止液誤作洗滌液稀釋或當?shù)孜锞彌_液配制 | 每次配制時都應(yīng)看清標簽標明物質(zhì) | ||
蒸餾水有問題 | 確認配制洗液的純化水達到要求且未污染,，與好蒸餾水比較,。 | ||
顯色弱、靈敏度低 | 實驗結(jié)束后,，包括陽性對照,、質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡,。 | 試劑盒超過期， 超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號,； 試劑盒沒有按規(guī)定進行保存,，受高溫影響； | 實驗前檢查試劑的組分及批號,，確認試劑未過期,。 不要將試劑盒長時間置于常溫下，按使用規(guī)定儲藏,。 |
試劑,、樣品用前未平衡至室溫 | 從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡 20分鐘左右。 | ||
加入試劑的體積和時間有誤,，移液器計量不準,，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔； | 確定所使用的試劑體積正確,，加入時間適當,。 校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合,。移液不宜太快,，排放應(yīng)*。 | ||
洗板及加樣過程中,，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等,，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染,。 | ||
孵育時間及孵育溫度未達到要求 ,，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時注意溫度并及時調(diào)整。 | 孵育溫度應(yīng)控制在 37-38℃,，孵育時間嚴格按照說明書操作,。 保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫,。 | ||
洗板次數(shù)過多,，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求；洗滌沖擊力太大,。浸泡時間太長,； | 嚴格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力,，按說明書要求置留洗滌液時間和洗滌次數(shù),。 | ||
顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入,； | 顯色劑滴瓶垂直向下,，持力均勻,，滴速不宜過快，先加顯色劑 A,，后加顯色劑B,，不可將A、B液混合后加入 | ||
底物作用時間不夠,； | 準確定時。 | ||
蒸餾水水質(zhì)有問題,； | 測定蒸餾水配制試劑對酶免疫法的影響,。 | ||
實驗結(jié)束后，陰陽性對照正常,，質(zhì)控正常,，但臨床標本感覺顯色較弱 | 待測標本中可能不含強陽性標本，故結(jié)果可能是正常的 | 如有懷疑,，可復(fù)檢 | |
標本加入疊氮鈉作為防腐劑 | 酶免實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑,，可選用 proclin、硫柳汞等其他防腐劑 | ||
陰陽性對照正常,，但質(zhì)控,、參考品或個別弱陽性標本未能檢出。 | 未達要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本,，但 質(zhì)控或弱陽性標本受 溫度變化影響較大而被未檢出 | 質(zhì)控品或標本避免反復(fù)凍融,。標本在一周內(nèi)使用的，可存于 2-8℃,，如需長期保存,，應(yīng)置于-20℃以下保存。質(zhì)控品應(yīng)小量分裝,，并置于-20℃以下保存,。 | |
質(zhì)控品或標本高溫放置過久，或被反復(fù)凍融致待測物滴度下降,，而未能檢出 | 重新設(shè)定酶標儀的參數(shù),，特別是檢查濾光片是否匹配。 | ||
儀器設(shè)定不正確,，濾光片不匹配 | 重新設(shè)定酶標儀的參數(shù),，特別是檢查濾光片是否匹配 | ||
靈敏度過高、板底高,、高背景 | 終止后,，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對照,、質(zhì)控正常,，標本陰性標本 OD值過高,。 | 整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯加其他試劑造成，如同時操作兩對半試劑時,，測 HbsAb板用于測HBsAg等,； | 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒,。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用 |
酶標對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象,； | 避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭,、容器的干凈 | ||
顯色劑在光照條件下放置過久,，實驗前已變藍 | 顯色劑 A、B未使用前避光保存 | ||
孵育溫度過高或孵育時間過長,； | 孵育溫度應(yīng)控制在 37-38℃,，孵育時間嚴格按照說明書操作。 | ||
未按要求洗板,。特別是洗滌時每孔未注滿洗液,，易造成花板黃板現(xiàn)象 | 嚴格按說明書要求洗板 | ||
花板，一般是由于臨床標本的收集,、處理和保存方法不當造成 | 放置時間（自然放置 1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）,、離心時間（15min）應(yīng)引起注意。 | ||
出現(xiàn)隨機性的花板,、跳孔現(xiàn)象 | 樣品離心不*,，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細胞成分； | 充分離心,， 3000rpm6分鐘以上,。 | |
加樣時交叉污染； | 加標本時盡量 避免交叉污染,。如盛標本的試管周圍常有血痂,，易脫落，應(yīng)遠離酶標板,。 | ||
手工洗板造成的交叉污染 | 手工洗板時前 3次注洗液后應(yīng)立即棄去,，后幾次再設(shè)定浸泡時間，可減少交叉污染 | ||
洗板機加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大,，造成 花板,、跳孔 | 疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液,，吸液時殘留量要小,。 | ||
拍板時交叉污染 | 洗板完畢拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進板孔，并盡量不要在同位置拍,，以免交叉污染,。 | ||
假陽性 | 假陽性現(xiàn)象是一個綜合現(xiàn)象，可參考上文“靈敏度過高,、板底高,、高背景”中的分析。這里只列舉常見的原因及對策,。 | 計算 Cutoff值時使用的公式不正確,，導(dǎo)致計算得出的CutOff值過低，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性 | CutOff值計算公式應(yīng)嚴格參照所屬產(chǎn)品的說明書,，應(yīng)注意各個酶免產(chǎn)品的Cutoff值計算公式不盡相同 |
洗板時未能注滿洗液或洗板次數(shù),、浸泡時間不夠， 洗滌不充分,，樣品中有其他成分殘留 導(dǎo)致花板、跳孔,，假陽性增多 | 嚴格按說明書要求洗板,。調(diào)整洗板機時，應(yīng)注意有時儀器標示的液量與實際液量并不相符,，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整至每孔注滿,。 | ||
血清標本處理不當，如未除去細胞成分,、纖維蛋白原及其它干擾物可出現(xiàn)孔底由變藍的跳孔現(xiàn)象,，此標本重復(fù)實驗結(jié)果往往是陰性； | 放置時間（自然放置 1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）,、離心時間（15min）應(yīng)引起注意 | ||
廠家試劑質(zhì)量的變化造成 | 國家標準要求提高靈敏度時,，廠家試劑靈敏度也相應(yīng)提高，假陽率常常有所上升,，但只要在合理范圍,，是可以接受的 | ||
水質(zhì)問題 | 防止蒸餾水污染 | ||
加酶量過多（如 50uL誤認為100uL）或丙肝酶稀釋時加量過多 | 加酶前檢查移液器調(diào)節(jié)量是否準確，稀釋酶時思想要集中 | ||
培養(yǎng)箱溫度超過 37℃</ |