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細胞破碎的方法
閱讀：3640 發(fā)布時間：2013-4-22
細胞破碎的方法
機械法
主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法,，常用的器械有組織搗碎機、勻漿器,、研缽和研磨,、壓榨器等。
1. 組織搗碎機
將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積,，蓋緊筒蓋,，將調(diào)速器先撥至慢處，開動開關(guān)后,，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織,、植物肉質(zhì)種子,、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達10000rpm/M以上,。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用,。
2. 勻漿器
先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨,，上下移動,，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離,。制作勻漿器的材料,，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料,、不銹鋼,、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,，適用于量少和動物臟器組織,。
存在的問題；較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌,，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器,，質(zhì)地堅硬,，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理,。
3. 研缽
多用于細菌或其他堅硬植物材料,，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑,，以提高研磨效果,。
4. 細菌磨
是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積,，而且低部有出口,。操作時先把細菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺,，研磨20-30秒即可將細菌細胞*磨碎,。
物理法
主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：
1. 反復凍溶法
原理：因突然冷凍,，細胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞,。
方法：將待破碎的細胞在-20度以下冰凍，室溫融解,，反復幾次,，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎,。
特點：此法適用于組織細胞,，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差,。
2. 急熱驟冷法
將材料投入沸水中,，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻,，此法可用于細菌及病毒材料,。
3. 超聲波處理
用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂,，此法多適用于微生物材料,，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,，頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。其破碎機理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān),。超聲破碎的效率與聲頻,、聲能、處理時間,、細胞濃度及首種類型等因素有關(guān),。
特點：操作簡單,，重復性較好，節(jié)省時間,；多用于微生物和組織細胞的破碎,。
存在問題：超聲波破碎在實驗室規(guī)模應用較普遍，處理少量樣品時操作簡便,，液量損失少,，但是超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞,，散熱均有困難,，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用,?？栈饔檬羌毎茐牡闹苯釉颍瑫r會產(chǎn)生活性氧,，所以要加一些巰基保護劑,。
化學及生物化學法
1. 自溶法
在一定PH和適當?shù)臏囟认拢媒M織細胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將,。此過程需較長時間,，常用少量防腐劑如甲苯、等防止細胞的污染,。
2. 酶溶法
利用各種水解酶,，如溶菌酶、纖維素酶,、蝸牛酶,、半纖維素酶、脂酶等,，將細胞壁分解,，使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感,，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后,，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。
特點：
a） 此法適用多種微生物,；
b） 具有作用條件溫和,；
c） 內(nèi)含物成分不易受到破壞；
d） 細胞壁損壞的程度可以控制,。
存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用,，這可能是導致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高,，限制了大規(guī)模利用,。若回收溶酶,，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差,，不同菌種需選擇不同的酶,。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取,，給進一步純化帶來困難,。
3. 化學滲透法
某些有機溶劑（如苯、甲苯）,、抗生素,、表面活性劑、金屬螯合劑,、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來,。其作用機理；化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成,。
特點：多用于破碎細菌,，且作用比較溫和；提取核酸時,，常用此法破碎細胞,。
存在的問題：時間長，效率低,；化學試劑毒性較強,，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑,；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞,。
小結(jié)
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中,，使大分子生物降解,，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用,；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,，加入苯化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部,，還可通過選擇pH,、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取,。
介紹的幾種,，可謂各有千秋，在實際應用中，應盡量考慮全面,，選擇科學、有效的方法,。|||順便提個問題：
關(guān)于反復凍融有很多資料,，但是都不夠詳細，想請教做過這方面的酷友們：
1,、重懸緩沖液（裂解液,？，PBS,？）
2,、凍溶溫度（液氮？,，-20,？，-80,？）
3,、解凍溫度（37？,，40,？）
4、反復次數(shù)（3 次以上,？）反復凍融實際上與超聲波破碎或酶解一起使用,，否則凍融后黏度很大，蛋白質(zhì)容易聚集,，通常都是反復凍融后超聲波處理,，這樣效果比較好<br />
你問的幾個問題其實都沒有具體答案，緩沖液,，溫度等都與具體蛋白質(zhì),，具體實驗要求有關(guān)，次數(shù)是基本達到你的要求即可
主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法,，常用的器械有組織搗碎機、勻漿器,、研缽和研磨,、壓榨器等。
1. 組織搗碎機
將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積,，蓋緊筒蓋,，將調(diào)速器先撥至慢處，開動開關(guān)后,，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織,、植物肉質(zhì)種子,、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達10000rpm/M以上,。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用,。
2. 勻漿器
先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨,，上下移動,，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離,。制作勻漿器的材料,，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料,、不銹鋼,、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,，適用于量少和動物臟器組織,。
存在的問題；較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌,，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器,，質(zhì)地堅硬,，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理,。
3. 研缽
多用于細菌或其他堅硬植物材料,，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑,，以提高研磨效果,。
4. 細菌磨
是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積,，而且低部有出口,。操作時先把細菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺,，研磨20-30秒即可將細菌細胞*磨碎,。
物理法
主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：
1. 反復凍溶法
原理：因突然冷凍,，細胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞,。
方法：將待破碎的細胞在-20度以下冰凍，室溫融解,，反復幾次,，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎,。
特點：此法適用于組織細胞,，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差,。
2. 急熱驟冷法
將材料投入沸水中,，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻,，此法可用于細菌及病毒材料,。
3. 超聲波處理
用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂,，此法多適用于微生物材料,，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,，頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。其破碎機理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān),。超聲破碎的效率與聲頻,、聲能、處理時間,、細胞濃度及首種類型等因素有關(guān),。
特點：操作簡單,，重復性較好，節(jié)省時間,；多用于微生物和組織細胞的破碎,。
存在問題：超聲波破碎在實驗室規(guī)模應用較普遍，處理少量樣品時操作簡便,，液量損失少,，但是超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞,，散熱均有困難,，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用,?？栈饔檬羌毎茐牡闹苯釉颍瑫r會產(chǎn)生活性氧,，所以要加一些巰基保護劑,。
化學及生物化學法
1. 自溶法
在一定PH和適當?shù)臏囟认拢媒M織細胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將,。此過程需較長時間,，常用少量防腐劑如甲苯、等防止細胞的污染,。
2. 酶溶法
利用各種水解酶,，如溶菌酶、纖維素酶,、蝸牛酶,、半纖維素酶、脂酶等,，將細胞壁分解,，使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感,，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后,，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。
特點：
a） 此法適用多種微生物,；
b） 具有作用條件溫和,；
c） 內(nèi)含物成分不易受到破壞；
d） 細胞壁損壞的程度可以控制,。
存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用,，這可能是導致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高,，限制了大規(guī)模利用,。若回收溶酶,，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差,，不同菌種需選擇不同的酶,。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取,，給進一步純化帶來困難,。
3. 化學滲透法
某些有機溶劑（如苯、甲苯）,、抗生素,、表面活性劑、金屬螯合劑,、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來,。其作用機理；化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成,。
特點：多用于破碎細菌,，且作用比較溫和；提取核酸時,，常用此法破碎細胞,。
存在的問題：時間長，效率低,；化學試劑毒性較強,，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑,；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞,。
小結(jié)
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中,，使大分子生物降解,，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用,；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,，加入苯化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部,，還可通過選擇pH,、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取,。
介紹的幾種,，可謂各有千秋，在實際應用中，應盡量考慮全面,，選擇科學、有效的方法,。|||順便提個問題：
關(guān)于反復凍融有很多資料,，但是都不夠詳細，想請教做過這方面的酷友們：
1,、重懸緩沖液（裂解液,？，PBS,？）
2,、凍溶溫度（液氮？,，-20,？，-80,？）
3,、解凍溫度（37？,，40,？）
4、反復次數(shù)（3 次以上,？）反復凍融實際上與超聲波破碎或酶解一起使用,，否則凍融后黏度很大，蛋白質(zhì)容易聚集,，通常都是反復凍融后超聲波處理,，這樣效果比較好<br />
你問的幾個問題其實都沒有具體答案，緩沖液,，溫度等都與具體蛋白質(zhì),，具體實驗要求有關(guān)，次數(shù)是基本達到你的要求即可