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序號(hào)	組分		數(shù)量		體積／人份
1	H7N9核酸熒光PCR檢測混合液		480?l×1		19?l
2	RT-PCR酶		28?l×1		1?l
3		DEPC-H2O		400?l×1
4		陽性對(duì)照品		30?l×1

說明：不同批號(hào)的組分不可以互換使用,。

自備試劑：Trizol,；氯仿；75%乙醇,；異丙醇或磁珠法RNA提取試劑,；本公司可以代為訂購或提供銷售商。

【儲(chǔ)存條件和有效期】試劑盒應(yīng)在－20℃及以下溫度避光保存,，有效期12個(gè)月,。采用冰盒行運(yùn)輸；熒光PCR檢測混合液反復(fù)凍融不宜超過3次,。

【適用儀器】本試劑盒適用于ABI7000,，ABI7300，ABI7500,，ABI7900,，MJ-chromo4，MX3000P,，MX3005P,，SmartCyclerⅡ，Rotor-Gene6000,，Lightcycler R480,，iCycleriQ4，iCycleriQ5,，Bio-Rad CFX96,，SLAN等多色熒光PCR儀及相應(yīng)軟件。

【標(biāo)本要求】

人體鼻腔或咽部分泌物:用無菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物,，將分泌物或咽拭子置入無菌玻璃管（含0.4ml滅菌生理鹽水）,，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢,。標(biāo)本可立即用于檢測,，也可保存于-20℃待測?！緳z驗(yàn)方法】

1.標(biāo)本,、對(duì)照品的核酸裂解處理

用商品化（取得醫(yī)療器械許可證）的RNA提取試劑盒處理標(biāo)本，具體操作參見該試劑盒說明書,。

或用Trizol法提取,，方法如下：取100?l樣品置于1.5ml 離心管中，加入300?l裂解液（Trizol）,，再加入100?l氯仿,，混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次,； 13000rpm離心15min，吸取上層液體,，加入等體積異丙醇,，顛倒混勻室溫靜置10min， 13000rpm離心10min,，輕輕倒去上清,；加入700?l 75%乙醇，顛倒洗滌,，13000rpm離心5min,，輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上,，棄盡液體或4000rpm離心5sec,，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量吸干液體,，加入20?l DEPC-H2O溶解RNA,。

2.試劑配制

取n×19?l H7N9核酸熒光PCR檢測混合液與n×1?l RT-PCR酶（n為反應(yīng)管數(shù)）,振蕩混勻數(shù)秒, 3000rpm離心數(shù)秒。

3.加樣取上述混合液20?l置于PCR管中,，然后將樣品核酸提取液,、DEPC-H2O、陽性對(duì)照品各5?l分別加入PCR管中,，蓋好管蓋，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),。

4. PCR擴(kuò)增反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上,，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

45℃×10min; 95℃×15min;循環(huán)一次，再按95℃×15sec→60℃×60sec,，循環(huán)45次;單點(diǎn)熒光檢測在60℃,，反應(yīng)體系為25?l。

熒光通道檢測選擇：選用FAM通道,。

備注：如使用ABI系列PCR儀,，請務(wù)必于passive reference 和 quencher處均選擇“none”。

5. 閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過DEPC-H2O的zui高點(diǎn),。

6. 質(zhì)量控制：試劑盒各對(duì)照品須達(dá)到以下要求,，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

Ct值
FAM通道（檢測H7）		HEX/VIC/JOE（檢測N9）
DEPC-H2O	UNDET或45		UNDET或45
陽性對(duì)照品	≤35		≤35

7. 試驗(yàn)結(jié)果的判斷

通道	Ct值		結(jié)果判斷
1	FAM+HEX	UNDET或45	樣本低于檢測限,，報(bào)告為陰性
2	FAM+HEX	≤43	FAM通道為H7基因陽性,； HEX/VIC/JOE通道為N9基因陽性
3	FAM+HEX	43～45	復(fù)檢一次,如仍為43～45,則報(bào)告為陰性

進(jìn)行定量檢測時(shí)，儀器生成標(biāo)準(zhǔn)曲線后,，自動(dòng)顯示待檢樣品定量值,。

【參考值范圍】陰性（檢測對(duì)象H7N9為病原微生物,，在健康人體中不存在）。

【對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染,，試劑污染,，樣品交叉污染會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果。

【檢驗(yàn)方法的局限性】當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于zui低檢測限5×103copies/ml時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】zui低檢測限：1×103copies/ml,；

【注意事項(xiàng)】開始檢測前請仔細(xì)閱讀本說明書全文。

1. 整個(gè)檢測過程應(yīng)嚴(yán)格分在三區(qū)進(jìn)行：PCR反應(yīng)體系的配制區(qū),；標(biāo)本處理,、加樣區(qū)；PCR擴(kuò)增,、熒光檢測及結(jié)果分析區(qū),。各區(qū)使用的儀器、設(shè)備,、耗材和工作服應(yīng)獨(dú)立,。實(shí)驗(yàn)后即請清潔工作臺(tái)，并進(jìn)行消毒,。

2. 使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套（經(jīng)常替換） ,、一次性離心管、自卸式移液器和帶濾嘴吸頭,。

3. 試劑準(zhǔn)備和標(biāo)本處理應(yīng)使用超凈工作臺(tái)（負(fù)壓式）或防污染罩,，以防止對(duì)環(huán)境污染。

4. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰,、陽性對(duì)照品,。

5. 操作人員應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，具有一定經(jīng)驗(yàn)和操作技能,。

6. 操作臺(tái),、移液器、離心機(jī),、PCR擴(kuò)增儀等儀器設(shè)備應(yīng)經(jīng)常用10%次氯酸或75%酒精,、紫外線燈或臭氧消毒處理。

7. 實(shí)驗(yàn)中接觸過標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品的廢棄物品（如吸頭）,、擴(kuò)增完畢的離心管,、標(biāo)本等應(yīng)進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。

8. 試劑使用前應(yīng)在常溫下充分融化并混勻,。

9. PCR反應(yīng)混合液應(yīng)避光保存,。

10. 反應(yīng)管中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊。

11. 不同批號(hào)的試劑請勿混用,，請?jiān)谟行趦?nèi)使用試劑盒,。

上海義森生物科技有限公司：,

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