1. 用途

RIDASCREEN® Zearalenon 玉米赤霉烯酮檢測試劑盒,，采用競爭性酶聯(lián)免疫法定

量測定谷物,、飼料,、啤酒,、血清和尿液中殘留的玉米赤霉烯酮含量,。

2. 概要

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌類的真菌形成,。它是一種植物性激素，并具雌激素性特

征。從而導致動物生育能力紊亂或降低,，臨床癥狀表現(xiàn)為雌激素過多,。此類疾病不

僅常見于肉豬，也出現(xiàn)在牛,、馬,、羊等牲畜上。而關于攝入霉菌毒素的植物或動物

器官等食品對人體導致的潛在健康危害更是頻頻被討論的焦點,。

3. 檢測原理

檢測的基礎是抗原抗體反應,。微孔板包被有特殊的玉米赤霉烯酮抗體。加入標準

品,、樣品溶液和酶標記的玉米赤霉烯酮（酶連接物）,。游離的玉米赤霉烯酮和酶連

接物競爭抗體結合位點（競爭性酶聯(lián)免疫分析）。沒有結合的酶連接物在洗滌步驟

中被除去,。

在孔中加入底物（過氧化脲）和發(fā)色劑（四甲基對二氨基聯(lián)苯）,，結合的酶連接物

將無色的發(fā)色劑轉化為藍色。加入反應終止液后顏色由藍色轉變?yōu)辄S色,。在 450

nm 處測量,，吸光度值與樣品中的玉米赤霉烯酮濃度成反比。

4. 試劑盒組份

每一個盒中的試劑足夠進行 96 次檢測（包括標準測定）,。盒中的組份如下：

1 x 96 孔微孔板（12 條每條 8 孔）

    包被有針對玉米赤霉烯酮的抗體

6 x 標準品（每瓶 1.3 ml）

    0 ppt （零標準品）,，50 ppt，150 ppt,，450 ppt,，1350 ppt，4050 ppt

    玉米赤霉烯酮水溶液

1 x 酶連接物（0.7 ml） .......................................................................... 紅色瓶蓋

    過氧化物酶標記的玉米赤霉烯酮

    濃縮液

1 x 底物（7 ml） .................................................................................... 綠色瓶蓋

    含有過氧化脲

1 x 發(fā)色劑（7 ml）................................................................................. 藍色瓶蓋

    含有四甲基對二氨基聯(lián)苯

1 x 反應終止液（14 ml）........................................................................ 黃色瓶蓋

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    含 1 N 的硫酸

1 x 緩沖液 1（50 ml）............................................................................ 白色瓶蓋

    樣品和酶連接物稀釋緩沖液

5. 另需的試劑和設備

5.1. 設備：

− 微孔板酶標儀（450 nm）

− 實驗用粉碎機和或糧食碾磨機

− 振蕩器

− 用于樣品處理：漏斗和玻璃長頸瓶（100 ml）

− 濾紙：Whatman No. 1 或者類似

− 離心機

− 旋轉蒸發(fā)器或者其他蒸發(fā)設備

− 巴氏吸液管

− 刻度移液管

− 20 µl - 200 µl 和 200 - 1000 µl 微量移液管

5.2. 試劑

− 甲醇

其他用于處理血清或尿液的必要試劑：

− Glucuronidase/Arylsulfatase aus Helix pomatia （Merck, Art. Nr.: 4114） 來源于羅

  曼蝸牛的葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（Merck 公司,，訂貨號：4114）

− RIDA® C18 column（訂貨號：R2002）

− 50 mM 乙酸鈉緩沖液,，pH 4.8

− 20 mM Tris 緩沖液，pH 8.5 / 甲醇（80/20）

6. 操作者應該注意之事項

標準品中含有玉米赤霉烯酮,，應特別小心,。避免皮膚接觸（使用手套）。

玻璃器具和有毒溶液用次氯酸鈉溶液（10 % （v/v））浸泡消毒夜（用 HCl 調(diào)節(jié)

溶液 PH 值為 7） ,。

反應終止液為 1 N 硫酸（R36/38,， S2-26）。

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7. 儲存條件

保存試劑盒于 2 - 8 °C,，不要冷凍,。

將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封儲存于 2 - 8 °C

條件下。

玉米赤霉烯酮對光敏感,，因此標準品要避免直接暴露在光線下,。

無色底物/發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

對過了有效期（見試劑盒標簽）的試劑盒不再提供任何質(zhì)量保證,。

不能交叉使用不同批號的盒中試劑。

8. 試劑變質(zhì)的跡象

− 底物/發(fā)色劑在使用前發(fā)現(xiàn)顏色變藍

− 零標準品的吸光度值小于 0.6 （E450 nm < 0.6）

9. 樣品處理

樣品應當避光冷藏保存,。

9.1. 谷物和飼料樣品

對采集的代表性樣品用實驗用粉碎機粉碎并充分混合

− 稱取 5 g 粉碎后的樣品,，加入 25 ml 甲醇/水（70/30）溶液*

− 用力振蕩 3 min（手動或借助振蕩器）

− 提取物離心：10 min / 3500 g /室溫（20 - 25 °C）或者使用 Whatman No. 1 濾

  紙過濾

− 上清液或者濾液用樣品稀釋緩沖液（緩沖液 1）按照 1:7 （1 + 6） 的比例稀釋（例

  如：100 µl 上清液或濾液 + 600 µl 緩沖液 1）

− 每孔取 50 µl 稀釋后的上清液或稀釋后濾液進行檢測

*） 樣品的用量可以適當?shù)脑龃螅羌状?水溶液的用量也應同比例增加,，比如

  10 g 樣品中加入 50 ml 70 % 甲醇/水溶液（70/30）

備注：

此甲醇提取物（上清液或濾液）可以在冰箱中（2 - 8 °C）保存 2 星期,，可以在冰

柜中（-20 °C）保存 2 個月。應保存于棕色玻璃瓶中并儲存于暗處,。

如果玉米赤霉烯酮的濃度預計較高,，必須用樣品稀釋緩沖液（緩沖液 1）繼續(xù)稀

釋。

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9.2. 啤酒樣品

− 去除足量啤酒樣品中的氣體（繼續(xù)減少碳酸的含量,，直到肉眼不能看見氣泡為

  止,，例如通過攪拌或者過濾）

− 去除氣體的啤酒樣品用樣品稀釋緩沖液（緩沖液 1）稀釋，稀釋比例為 1：5（1

  + 4）（例如：100 µl 樣品 + 400 µl 緩沖液 1）

− 每孔 50 µl 進行檢測

備注：

對于有渾濁的啤酒樣品（例如酵母小麥啤酒）,，在去除氣體后必須對樣品進行無菌

過濾,，然后再進行檢測！

9.3.血清和尿液

僅針對尿液的處理：

− 取 0.5 ml 尿液樣品用 50 mM 乙酸鈉緩沖液,，pH 4.8 稀釋

− 加入 8 µl 羅曼蝸牛葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶

− 在 37 °C 條件下孵育 3 小時

使用 RIDA® C18 column （訂貨號：R2002）對 3.5 ml 水解尿或血清（未處理）按

照如下步驟純化：

− 滴速為 1 滴/秒

− 使用 3 ml 甲醇（100 %）洗滌層析柱

− 使用 2 ml 20 mM Tris 緩沖液,，pH 8.5 / 甲醇（80/20）平衡層析柱

− 水解尿或者 0.5 ml 血清上柱

− 使用 2 ml 20 mM Tris 緩沖液，pH 8.5 / 甲醇（80/20）洗脫

− 使用 3 ml 甲醇溶液（40 %）洗脫

− 壓入或吸出空氣對層析柱進行干燥（1 分鐘）

− 使用 1 ml 甲醇溶液（80 %）緩慢洗脫樣品（15 滴每分鐘）

− 蒸發(fā)洗脫液,，zui高溫度 60 °C（盡量在通風廚中弱氮氣流條件下）

− 干燥殘留物溶解于 50 µl 甲醇中,，加入樣品稀釋緩沖液 450 µl（緩沖液 1）并充

  分混合

− 每孔 50 µl 進行檢測

備注：

可根據(jù)需求提供肉類和奶類樣品的處理方法。

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10. 檢測步驟

10.1. 檢測前的準備

使用之前將所有試劑回溫至室溫（20 - 25 °C）,。

玉米赤霉烯酮酶連接物（紅色瓶蓋瓶子）為濃縮液,。由于稀釋的酶連接物的弱穩(wěn)定

性，所以只稀釋實際需用量的酶連接物,。 在吸取濃縮液之前,，要仔細地輕輕振搖。

用緩沖液 1（白色瓶蓋的瓶子）以 1:11（1 + 10）的比例稀釋酶連接物濃縮液（例

如：200 µl 濃縮液 + 2.0 ml 緩沖液,，足夠 4 個微孔板條用）,。

10.2. 檢測操作

仔細進行洗板的操作非常重要。在使用中不要讓微孔出現(xiàn)干燥,。

1. 將足夠標準品和樣品檢測所需數(shù)量的孔條插入微孔板架,，均做兩個平行實驗，

   記錄下標準品和樣品的位置,。

2. 將 50 µl 標準品及處理好的樣品溶液加到相應的微孔中,，均做兩個平行實驗。

3. 向每一個微孔中加入 50 µl 稀釋后的酶連接物溶液，充分混合后在室溫（20 -

   25 °C）條件下暗處孵育 2 小時,。

4. 倒出孔中的液體,，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打 3 次）以保證完

   全除去孔中的液體。加入 250 µl 蒸餾水洗滌微孔,。上述操作重復進行兩遍,。

5. 向每一個微孔中加入 50 µl 底物和 50 µl 發(fā)色劑，充分混合后在室溫（20 - 25

   °C）條件下暗處孵育 30 分鐘,。

6. 向每一個微孔中加入 100 µl 反應終止液,，充分混合。在加入反應終止液后 30

   分鐘內(nèi)于 450 nm 處測量吸光度值,。

11. 結果評估

請使用 R-Biopharm 德國拜發(fā)公司專門為 RIDASCREEN® 系列產(chǎn)品設計的應用軟件

RIDA® SOFT Win（訂貨號：Z9999）來進行結果分析,。

對單次檢測建議使用Logit/log 曲線進行結果分析，對兩次或多次平行檢測應該使用

Cubic Spline 曲線進行結果分析,。

關于標準曲線請參看試劑盒中附帶的質(zhì)保證書,。

以下是沒有使用軟件的計算方法：

標準品的吸光度值（或樣品）

-----------------------------x 100 = % 吸光度比值

零標準品的吸光度值

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吸光度值以百分比表示，因此零標準品等同于 100 %,。計算標準品相應的比值,，并

繪成一個與玉米赤霉烯酮濃度（ng/kg）相關的半對數(shù)坐標系統(tǒng)的曲線圖。根據(jù)每

個樣品對應的吸光度值,，從校正曲線中讀出樣品中玉米赤霉烯酮的濃度

（ng/kg）,。

為了獲得樣品中玉米赤霉烯酮的實際濃度 ng/kg，從校正曲線上讀出的濃度值必須

乘以相對應的樣品稀釋倍數(shù),。按照說明書中給出的方法進行操作,，樣品稀釋倍數(shù)

為：

谷物和飼料樣品 .......................................... 35

啤酒樣品 ....................................................... 5

尿液和血清樣品 ............................................ 1

以上信息是基于我們現(xiàn)有知識的基礎上對我們的產(chǎn)品及其相關應用的說明。而

并非對產(chǎn)品的任何特定性能或特定使用目的進行擔保,。R-Biopharm 德國拜發(fā)

公司不承擔除試劑基本品質(zhì)之外的任何責任,。除因產(chǎn)品使用而造成的直接或間

接損壞及損失外，其它有缺陷的試劑盒可退換,。

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