SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，使用方法,；
1,、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：
取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶,，拆下封口膜，放入37℃,，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
2,、細(xì)胞傳代：
1)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次,；
2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；
3)棄上清,，沉淀細(xì)胞用12ml*培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代,，后放入37℃,，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4)待細(xì)胞*貼壁后,，觀察培養(yǎng)結(jié)果,，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
3,、細(xì)胞凍存：
1)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次,；
2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；
3)用適量的凍存液(FBS：DMSO=9 ：1)重懸細(xì)胞,，并放置于凍存管中；
4)先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,，然后將其移入-80℃過(guò)夜,，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃,。
4,、細(xì)胞復(fù)蘇：
1)從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意：佩戴防爆管面具)，快速將其置入37℃水浴中解凍,，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶,，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2)將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中,， 1000rpm離心5min,；
3)棄上清，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸,，接種25cm2培養(yǎng)瓶,，于37℃,，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4)第二天,，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。
SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，細(xì)胞傳代：收到細(xì)胞后,，請(qǐng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表進(jìn)行消毒,，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行 1-2 小時(shí)的緩沖，待細(xì)胞恢復(fù)基本生長(zhǎng)狀態(tài)后,，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn),。在倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：
(一)細(xì)胞未長(zhǎng)至 85%時(shí)，用 75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到生物操作臺(tái)內(nèi),，嚴(yán)格無(wú)菌操作,，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，若培養(yǎng)瓶上無(wú)特殊標(biāo)注,，吸去剩余培養(yǎng)液,，只留 6-8ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
(二)細(xì)胞已長(zhǎng)滿(達(dá) 85-95%),。即可進(jìn)行傳代,，具體步驟如下：
1.棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌 1-2 次,，
2.加入 1.0ml 胰酶消化液,，37℃消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞回縮變圓,、透亮、輕拍甁壁呈流沙樣脫落,，則迅速拿回操作臺(tái),，加入雙倍的含 10%血清的*培養(yǎng)液，終止消化并輕輕吹打細(xì)胞,，使其變成單細(xì)胞懸液,，
3.將細(xì)胞收集于離心管中離心 1000rmp/5min，棄上清,，輕彈管底,，將細(xì)胞彈散，
4.加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，進(jìn)行傳代,、凍存，
5.如果沒(méi)有特別說(shuō)明，建議收到細(xì)胞后的次傳代比例為 1:2,。
