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培養(yǎng)箱中微生物菌種保藏方法及注意點
閱讀：1602 發(fā)布時間：2019-10-10
1,、傳代保存法：有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時,，會很快死亡，因此在這種情況下,，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法,。傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉接、培養(yǎng)后再保存,，它是基本的微生物保存法,，例如酸奶等常用生產菌種的保存。
傳代保存時,，培養(yǎng)基的濃度不宜過高,，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低,。培養(yǎng)溫度通常以稍低于適生長溫度為好,。若為產酸菌種，則應在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣,。
一般地,，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌,、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存,，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。
傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯,，如：①菌種管棉塞經常容易發(fā)霉,；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復傳代時,，菌株的病原性,、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉種,，工作量大,；⑤雜菌的污染機會較多。
2,、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長,，適用于霉菌、酵母菌,、放線菌及需氧細菌等的保存,。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的,。其具有方法簡便的優(yōu)點,，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細菌如固氮菌,、乳酸桿菌,、明串珠菌、分枝桿菌,、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌,、小克銀漢霉、毛霉,、根霉等不宜采用此法進行保存,。
3、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法,。常用的有方法包括以下幾種,，如①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥,，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,，土壤需風干,、粉碎、過篩和滅菌,。
使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中,，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基（以含水量為土壤大持水量的60%為宜）,，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種,，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認的程度為止,，移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封，冷藏或室溫保存,。
?、谏巴帘４娣ǎ喝∏鍧嵉纳埃^60目篩去掉大砂粒,，并用磁鐵吸去砂中鐵屑,，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數(shù)次,，干燥后,，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經干熱滅菌后,，加入1ml菌種培養(yǎng)液,，經充分混勻后，放入真空干燥器中,，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂（經HCl預處理）和一份貧瘠,、過篩的黃土攙和后滅菌,，再進行菌種保藏。
?、酃枘z保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子,，干熱滅菌后，加入菌液,。加菌液時,，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻,。
?、艽胖楸４娣ǎ簩⒕航胨責胖椋ɑ蚨嗫撞Ａе椋┖笤龠M行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無水CaSO4）,，上鋪玻璃棉,，再放上10～20粒磁珠，經干熱滅菌后,，接入菌懸液,，后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏,。本法對酵母菌很有效,，特別適用于根瘤菌,，可保存長達兩年半時間。
?、蓰熎け４娣ǎ涸邴熎燃尤?0%的水,，經滅菌后接種培養(yǎng)，后干燥保藏,。
?、藜埰V紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后,，置于裝有干燥劑的容器內進行保存,。
4、懸液保存法：即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法,。常用的有,，①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年,。本法應注意避免水分的蒸發(fā)。
?、谔且罕４娣ǎ哼m用于酵母菌,，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存,，可長達10年,。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存,。
5,、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6,、冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物,。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言,，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結,，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時,，應注意以下幾點,，①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；②要選擇適宜的培養(yǎng)基,，因為某些微生物對冷凍的抵抗力,，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異；③要選擇合適的菌液濃度,，通常菌液濃度越高,，生存率越高,，保存期也越長；④在菌液內不添加電解質（如食鹽等）,；⑤可在菌液內添加甘油等保護劑,，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣,，也可添加各種糖類,、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言,，不加保護劑時更有效,。
⑥原則上應盡快進行冷凍處理,，但當加入保護劑時,，可靜置一段時間后再進行處理。
?、呔蛣游锛毎?，應在－20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度,；而對絕大多數(shù)微生物而言,，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在－35℃范圍內進行緩慢降溫,，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍,；⑧若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好,；⑨取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施,，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解,。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施,。當冷凍菌融化后,，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降,。
常用的冷凍保存法包括：
?、俚蜏乇浔４娣ǎǎ?0℃、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便,，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜,。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑,。此外,，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,，然后把玻璃珠置于塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的,。
?、诟杀４娣ǎǎ?0℃左右）：即將菌種管插入干冰內，再置于冰箱內進行冷凍保存,。
?、垡旱４娣ǎǎ?96℃）：是適用范圍廣的微生物保存法。其操作步驟如下,，a,、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中,，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
b,、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（－150℃～－170℃）時,，則不需熔封。
c,、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下,，將熔封安瓶管在適當?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀察有無色素進入安瓶,。
d,、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至－25℃左右,，也可在－20℃～－25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min,。
e、速冷：后浸入液氮中快速冷卻至－196℃,。
7,、冷凍干燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分,。事實上,，從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動就會停止,，因此可以達到長期維持生命狀態(tài)的目的,。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。
在進行冷凍干燥時,，需注意以下幾個問題：
a,、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗菌種純度。一般地說,，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)為宜,；菌齡以達到對數(shù)生長期為好,；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好,；菌液濃度以高為好,，如細菌應達到109～1010/ml。
b,、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽,。
c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,，自來水沖洗3次后,，蒸餾水刷凈，干燥,，塞棉塞,，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后,，60℃恒溫干燥,。
d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳,、12%蔗糖,、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8,、Bordelli氏法：取干凈的小試管（8×60mm）塞上棉塞,，滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,，制成濃厚菌懸液,。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴,，然后轉動小試管使菌液分散在試管底部的壁上,。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中,，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH）,，管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,，蠟封,。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時,，將玻璃管熔封,，置室溫暗處或冰箱保存。
儀器與材料1,、斜面菌種：絲狀真菌,、酵母菌,、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支。
2,、接種用具一套,。
3、滅菌物品：1ml,、5ml吸管,，長滴管，安瓶管,，9ml無菌水試管,，砂土管，液體石蠟,，脫脂牛乳,。其中，液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時或1kg/cm2壓力滅菌3次,，每次30分鐘,。接著檢查是否*無菌，即接入肉湯中檢查有無雜菌生長,。后放在60～80℃轟烤以去除水分,。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂，然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘,，或間歇滅菌3次,，經檢查無菌后備用。
4,、P2O5,，無水CaCl2各一瓶。
5,、真空干燥器,，真空泵。
方法1,、液體石蠟覆蓋法：取待保存的菌種斜面,，用5ml無菌吸管向內加入滅菌石蠟，要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右,，若不夠此高度,，則常會引起斜面抽干現(xiàn)象。
2,、砂土管法：用1ml無菌吸管吸取0.2～0.5ml菌懸液,，滴入砂土管中，充分混勻后，將砂土管放入真空干燥器內,，抽干,，真空干燥器內需放置無水CaCl2。后,，將干燥好的砂土管取出,，迅速于火焰上蠟封管口，并在室溫下或冰箱中進行保存,。
3,、冷凍干燥保藏法：
①用滅菌長滴管取出2滴（約0.1ml）無菌脫脂牛乳,，置于無菌安瓶管中,，然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液，同樣置于此安瓶管中,，充分混勻,。
②集中安瓶管,，置于100ml燒杯中,，將燒杯裝進真空冷凍干燥器的鐘罩內，開機并開冷卻水后,，使菌液在－20℃溫度下迅速凍結成固體,，然后抽真空使水分升華，2小時后,，可以停止冷凍并在稍高的溫度下進行干燥,，直至全干為止。
?、酆笕〕霭财抗?，并將其與真空泵連接，再抽真空后,，迅速將安瓶管熔封,，后冰箱保存。
4,、甘油管保藏法：在5ml菌種保藏管中,，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于－20℃冰箱中保存,。