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熒光定量PCR儀選擇要規(guī)避的問題
閱讀：2242發(fā)布時間：2016-4-21
熒光定量PCR選擇的兩個誤區(qū)：
誤區(qū)一：儀器通道越多越好
隨著PCR技術的成熟運用,，多重擴增越來越熱鬧,，熒光定量PCR儀也不能幸免,。從zui初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,，眼花繚亂的選擇讓人無所適從,，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區(qū)。
在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時,，為了確保實驗結果的性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或的Reference dye ,，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來,，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本,。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多,。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要,，不能單單只聽宣傳?？紤]多重熒光定量PCR的通道數(shù)的時候也應該從實驗室實際情況出發(fā),，多重PCR并非人人適用、人人可用,，因為它使實驗復雜化了,。
誤區(qū)二：real-time PCR儀無需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值),，但運用的公式不同,、引物序列不同，Tm值的差異會很大,。引物的熔解溫度決定了退火溫度,。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷,，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準確的結果,，退火溫度細微的差異對結果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題,。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內按照梯度變化,，根據(jù)結果，一步就可以摸索出的反應條件,。
不單退火溫度,，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech,、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要,，因為Taq和校正酶的*反應溫度可能有顯著差異,，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優(yōu)化過程,，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗,，既節(jié)省實驗時間提率，又節(jié)省實驗成本,。
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