昆蟲細胞的保存培養(yǎng)實驗

1. 將 3 ml 含 10％ 胎牛血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基 TNM-FH 加入到一個 60 mm 組織培養(yǎng)皿或 25 cm2 培養(yǎng)瓶中,。

2. 取出一支凍存 Sf 9 細胞的安瓿，迅速置于 37℃ 水浴,，用手前后搖動融化,。當安瓿的內容物幾乎融化時,，將安瓿浸入 70％ 乙醇，消毒外壁,。

3. 打碎安瓿頸部,，將內容物轉移至步驟 1 的 60 組織培養(yǎng)皿或 25 cm2 培養(yǎng)瓶。用手輕輕搖動,，使細胞分散均勻，置 27℃ 溫育 2～3 h 直到細胞貼壁,。

4. 除去舊培養(yǎng)液,，換 3 ml 新鮮培養(yǎng)液 TNM-FH/10％FBS,，繼續(xù)溫育,。每 3 天換液一次（除去舊培養(yǎng)液換新鮮的），直到細胞生長匯片（形成擁擠的單層培養(yǎng)物）,。

5. 當 Sf 9 細胞已生長匯片時，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,。加入新鮮的培養(yǎng)液,，用移 液管輕柔吹打重懸細胞。

6. 用為培養(yǎng)組織細胞設計的血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞,。在血細胞計數(shù)器小方格上的每一個細胞相當于 104 細胞/ml,。

7. 在一個新的 60 mm 組織培養(yǎng)皿或 25 cm2 培養(yǎng)瓶中接種來自步驟 5 的（1～2）× 106 個細胞，搖動培養(yǎng)瓶使細胞均勻分布（如果制備大量培養(yǎng)細胞,，可用大的培養(yǎng)瓶,，裝入更多的培養(yǎng)液）。加入新鮮培養(yǎng)液 TNM-FH/ 10％ FBS 至終體積 3 ml,。

8. 27℃ 溫育，每 3 天用 TNM-FH/10％ FBS 培養(yǎng)基換液,，直到培養(yǎng)瓶中的細胞生長匯片,。

9. 棄去匯片的單層培養(yǎng)細胞中的培養(yǎng)液,，并重懸細胞（同步驟 5）,，用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞,。

10. 以（4～5）× 105 細胞/ml 的密度將細胞接種于一個旋轉培養(yǎng)瓶中,，27℃ 溫育,，以 60～80 r/min 的速度恒速攪拌,。輕微開啟旁邊的通氣孔，以保證充足的空氣,。

11. 每隔 2 或 3 天進行細胞計數(shù)（見附錄 3F）,。當細胞密度達到（2～2.5）× 105 /ml 時 進行傳代，將適量細胞移至一個含有新鮮培養(yǎng)液 TNM-FH/10％ FBS 的新培養(yǎng)瓶中,，使終密度達到（4～5）× 105/ml,。

12. 在 1 ml 對數(shù)生長的細胞中加入 0.1 ml 的 0.4％ 臺盼藍，測定細胞活力,。在低倍顯 微鏡下檢查細胞,，計數(shù)被臺盼藍染色的細胞（死細胞）和總細胞數(shù)，計算出死細胞和活細胞的百分比例,。

13. 將單層培養(yǎng)細胞（從步驟 5）或懸浮培養(yǎng)細胞（從步驟 11）傳代至由 1 份 TNM-FH/10％FBS 培養(yǎng)液和 1 份無血清培養(yǎng)液（Bacu 10 Gold,，Sf-900 II 或 ExCell 401）組成的混合培養(yǎng)液中。讓細胞長至匯片（單層培養(yǎng)）,，或達到（2～3）× 106 細胞/ml 的密度（懸浮培養(yǎng)）,。

14. 按步驟 13 的方法重復，將細胞傳代至 TNM-FH/10％FBS 培養(yǎng)液與無血清培養(yǎng)液比例為 1 : 3 的混合培養(yǎng)液中,，使細胞生長,。

15. 按步驟 13 的方法，用培養(yǎng)液與無血清培養(yǎng)液比例為 1: 7 至 1 : 9 的混合培養(yǎng)液,，重復細胞傳代與細胞生長的步驟,。

16. 用無血清培養(yǎng)液傳代細胞。

17. 計數(shù)呈對數(shù)生長的待凍存細胞（見附錄 3F）,。

18. 室溫以 1000 g（GH-3.7 轉子為 2000r/min）離心 10 min,， 棄去上清液。

19. 用 TNM-FH/10％ FBS 培養(yǎng)液以（1～2）× 107 細胞/ml 的密度重懸細胞團塊,。加入等體積含 20％ DMSO 的 TNM-FH/10％ FBS 培養(yǎng)液,，將細胞置于冰浴。吸出 1 ml 細胞懸液,，移入帶螺口蓋的凍存管中,，置于 -20℃ 1 h，然后 -70℃ 過夜,。

20. 將凍結的細胞移至液氮罐中以便長期保存,。