昆蟲(chóng)細(xì)胞的保存培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1. 將 3 ml 含 10％ 胎牛血清的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基 TNM-FH 加入到一個(gè) 60 mm 組織培養(yǎng)皿或 25 cm2 培養(yǎng)瓶中,。

2. 取出一支凍存 Sf 9 細(xì)胞的安瓿,，迅速置于 37℃ 水浴,，用手前后搖動(dòng)融化,。當(dāng)安瓿的內(nèi)容物幾乎融化時(shí),，將安瓿浸入 70％ 乙醇,，消毒外壁,。

3. 打碎安瓿頸部，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至步驟 1 的 60 組織培養(yǎng)皿或 25 cm2 培養(yǎng)瓶,。用手輕輕搖動(dòng),，使細(xì)胞分散均勻，置 27℃ 溫育 2～3 h 直到細(xì)胞貼壁,。

4. 除去舊培養(yǎng)液,，換 3 ml 新鮮培養(yǎng)液 TNM-FH/10％FBS,，繼續(xù)溫育。每 3 天換液一次（除去舊培養(yǎng)液換新鮮的）,，直到細(xì)胞生長(zhǎng)匯片（形成擁擠的單層培養(yǎng)物）,。

5. 當(dāng) Sf 9 細(xì)胞已生長(zhǎng)匯片時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,。加入新鮮的培養(yǎng)液,，用移 液管輕柔吹打重懸細(xì)胞。

6. 用為培養(yǎng)組織細(xì)胞設(shè)計(jì)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞,。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器小方格上的每一個(gè)細(xì)胞相當(dāng)于 104 細(xì)胞/ml,。

7. 在一個(gè)新的 60 mm 組織培養(yǎng)皿或 25 cm2 培養(yǎng)瓶中接種來(lái)自步驟 5 的（1～2）× 106 個(gè)細(xì)胞，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布（如果制備大量培養(yǎng)細(xì)胞,，可用大的培養(yǎng)瓶,，裝入更多的培養(yǎng)液）。加入新鮮培養(yǎng)液 TNM-FH/ 10％ FBS 至終體積 3 ml,。

8. 27℃ 溫育,，每 3 天用 TNM-FH/10％ FBS 培養(yǎng)基換液，直到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)匯片,。

9. 棄去匯片的單層培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)液,，并重懸細(xì)胞（同步驟 5），用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞,。

10. 以（4～5）× 105 細(xì)胞/ml 的密度將細(xì)胞接種于一個(gè)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中,，27℃ 溫育，以 60～80 r/min 的速度恒速攪拌,。輕微開(kāi)啟旁邊的通氣孔,，以保證充足的空氣。

11. 每隔 2 或 3 天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（見(jiàn)附錄 3F）,。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到（2～2.5）× 105 /ml 時(shí) 進(jìn)行傳代,，將適量細(xì)胞移至一個(gè)含有新鮮培養(yǎng)液 TNM-FH/10％ FBS 的新培養(yǎng)瓶中，使終密度達(dá)到（4～5）× 105/ml,。

12. 在 1 ml 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中加入 0.1 ml 的 0.4％ 臺(tái)盼藍(lán),，測(cè)定細(xì)胞活力。在低倍顯 微鏡下檢查細(xì)胞,，計(jì)數(shù)被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞（死細(xì)胞）和總細(xì)胞數(shù),，計(jì)算出死細(xì)胞和活細(xì)胞的百分比例。

13. 將單層培養(yǎng)細(xì)胞（從步驟 5）或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（從步驟 11）傳代至由 1 份 TNM-FH/10％FBS 培養(yǎng)液和 1 份無(wú)血清培養(yǎng)液（Bacu 10 Gold,，Sf-900 II 或 ExCell 401）組成的混合培養(yǎng)液中,。讓細(xì)胞長(zhǎng)至匯片（單層培養(yǎng)），或達(dá)到（2～3）× 106 細(xì)胞/ml 的密度（懸浮培養(yǎng)）,。

14. 按步驟 13 的方法重復(fù),，將細(xì)胞傳代至 TNM-FH/10％FBS 培養(yǎng)液與無(wú)血清培養(yǎng)液比例為 1 : 3 的混合培養(yǎng)液中,，使細(xì)胞生長(zhǎng)。

15. 按步驟 13 的方法,，用培養(yǎng)液與無(wú)血清培養(yǎng)液比例為 1: 7 至 1 : 9 的混合培養(yǎng)液,，重復(fù)細(xì)胞傳代與細(xì)胞生長(zhǎng)的步驟。

16. 用無(wú)血清培養(yǎng)液傳代細(xì)胞,。

17. 計(jì)數(shù)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的待凍存細(xì)胞（見(jiàn)附錄 3F）,。

18. 室溫以 1000 g（GH-3.7 轉(zhuǎn)子為 2000r/min）離心 10 min， 棄去上清液,。

19. 用 TNM-FH/10％ FBS 培養(yǎng)液以（1～2）× 107 細(xì)胞/ml 的密度重懸細(xì)胞團(tuán)塊,。加入等體積含 20％ DMSO 的 TNM-FH/10％ FBS 培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于冰浴,。吸出 1 ml 細(xì)胞懸液,，移入帶螺口蓋的凍存管中，置于 -20℃ 1 h,，然后 -70℃ 過(guò)夜,。

20. 將凍結(jié)的細(xì)胞移至液氮罐中以便長(zhǎng)期保存。