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一,、原理
糧食飼料版T2毒素ELISA檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中T2毒素的殘留量。
二,、適用范圍
定量檢測糧食,、飼料等樣品中T2毒素的殘留。
三,、糧食飼料版T2毒素ELISA檢測試劑盒特點及技術指標
* 檢 測 時 間 ： 30 min
* 試劑盒靈敏度： 1ppb(µg/kg)
* 樣本處理方法簡單,，并與赭曲霉前處理方法部分統(tǒng)一化，節(jié)省了人力物力,；
* 試劑盒提供工作濃度標準品,，使用更方便；
* 試劑盒檢測樣本的靈敏度和準確度：
樣本 | 檢測下限 | 回收率 |
糧食 | 100pb | 70%-120% |
飼料 | 100pb | 70%-120% |
試劑盒特異性：
藥物名稱 | 交叉反應率（%） |
T2毒素 | * |
玉米赤霉烯醇 | ＜ 1% |
四,、所需材料
儀器：微孔板酶標儀450 nm/630 nm,、振蕩器、離心機,、刻度移液管（10 mL）,、洗耳球,、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）,、漏斗,、分液漏斗、燒杯,、定量分析濾紙
微量移液器：單道 1µL～10 µL,、10 µL～100µL
多道 50µL～300µL
試劑：甲醇、去離子水,。
五,、 試劑盒組成
序號 | 組成部分 | 96T裝量 |
1 | T2毒素酶標板 | 12×8孔 |
2 | T2毒素標準品*5 | 0.5-1 mL |
3 | T2毒素酶標物 | 7 mL |
4 | T2毒素抗體 | 7mL |
5 | 底物液A液 | 7 mL |
6 | 底物液B液 | 7 mL |
7 | 終 止 液 | 7 mL |
8 | 20×濃縮洗滌液 | 40 mL |
9 | 2×T2毒素樣品稀釋液 | 40mL |
*注：A、B,、C,、D、E共5個標準品濃度為：0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 27ppb,，A,、B標準品各1mL，其余各0.5mL,，直接使用,。
六：溶液配制
配液1: 洗滌工作液
用去離子水將20 ×濃縮洗滌液按1 : 19體積比進行稀釋。配好的洗滌工作液在4 ℃環(huán)境可保存一 個月,，用前一天取出回溫,。
配液2: 1×T2毒素樣品稀釋液
用去離子水將2×T2毒素樣品稀釋液按1:1體積比進行稀釋，用于樣本的稀釋,，配好后在4℃環(huán)境可保存一個月,，用前一天取出回溫。
配液3: 樣品提取液
將甲醇與去離子水按V甲：V水=4:1 體積比配制成80%甲醇,，即樣品提取液,。
七、樣本前處理
樣本處理前須知：
① 處理完的樣品應及時進行下步檢測,，實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭。
② 樣本數目超過8個時推薦使用排槍加樣,。
乳豬料,、豬育肥料、花生粕,、牛飼料,、 全麥、全玉米（稀釋倍數：100倍）
① 稱取粉碎樣品1.0 g ± 0.05 g至離心管中,，加入 10 mL 樣品提取液（配液3）,， 震蕩提取1 min,；
② 4000 r / min離心5 min；
③ 小心移取上清液100 μL 加到400μL 1 ×T2毒素樣品稀釋液中,， 混勻,，取50 μL用于分析。
八,、 酶標免疫測定程序
加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s,，甩去孔內液體,，重復洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）,。
液B液50µL/孔,，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
九、 結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標,，以T2毒素標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標,，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中T2毒素實際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件,，以便進行大量樣本的分析計算,。）
十,、 注意事項
① 洗板拍干后應立即進行下一步操作。
② 反應終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚,。
③ 不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號的試劑,。
④ 0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時,，表示試劑可能變質。
⑤ 在加入底物液A液和底物液B液后,，一般顯色時間為10～15min即可,。若顏色較淺，可延長反應時間到20min,，反之則減短反應時間,。
⑥ 未提及樣本請致電本公司技術服務部。
十一,、貯藏條件及保存期
貯藏條件： 2～8℃
保 質 期： 12個月
十二,、問題與對
序號 | 現象 | 可能原因 | 解決方法 |
1 | 板條不顯色或者無相應數值 | 試劑使用順序混亂，或操作步驟出錯 | 嚴格遵循實驗說明重復實驗 |
使用了不同批次的試劑 | 確保試劑來自同一試劑盒 | ||
板條受潮嚴重 | 板條要封好,，干燥劑失效要及時更換 | ||
2 |
低 吸 光 度
OD 值
| 試劑過期,，或者不同的批次混用 | 查證過期試劑和批次 |
洗液配制錯誤、洗滌浸泡時間過長 | 按照說明書要求洗滌,，并正確配制洗液 | ||
孵育時間過短 | 按照說明書要求,，嚴格計算好時間 | ||
試劑污染 | 確保吸取不同液體更換新的槍頭和盛放器皿 | ||
試劑溫度過低 | 根據試劑體積大小回溫時間相應延長，確保試劑*回溫 | ||
使用錯誤波長讀數,，或者酶 標儀失靈 | 確保450nm波長讀數,，檢查酶標儀是否故障 | ||
試劑盒處于的條件 | 使用完畢的部分請立即放回冰箱，勿置于過熱環(huán)境時間太長 | ||
3 | 過高的 背景值或吸光度（OD值） | 使用了質量差的水配制試劑 | 使用雙蒸水或去離子水配制試劑 |
洗滌不當或者洗板機洗板效果不好 | 增加1-2次洗滌,，每孔至少加入250μL洗液 | ||
酶標儀失靈,，如OD值讀數很高而顏色很淺 | 使用校正微孔板檢查酶標儀，檢查光源 | ||
實驗室溫度過高,，反應時間過長 | 測定操作溫度是否合適,，時間是否計算正確 | ||
試劑混淆，被污染或者配制不當 | 確保使用正確的試劑,，準確配制,，避免污染 | ||
4
| 板內 差異性 大 | 加入標準品和樣品等的時間不* | 使用多道槍加樣，同種試劑加樣途中不能中斷 |
多道槍使用不當 | 校準多道槍,，檢查吸嘴是否套緊,，確保吸液量* | ||
洗滌系統(tǒng)出現故障 | 檢查洗滌系統(tǒng)，保持良好運行 | ||
5 | 板 間 差 異 性 大
| 板與板之間孵育時間相差太大 | 獨立計時，確保*的孵育時間 |
板與板之間不*的洗滌過程 | 確保相同的洗滌次數,，保證洗滌系統(tǒng)正常運作 | ||
使用移液槍不當 | 檢查移液槍,，確保吸取相同液量 | ||
試劑和樣品處于不同溫度 | 確保盒內試劑和樣品液等充分回溫，如果試劑體積較大則需要回溫較長時間,。不能用溫水浴回溫樣品 | ||
不同批次的試劑混用,，或試劑盒過期 | 試劑不要混用，通常0標準品的OD值小于0.5顯示試劑質量下降 | ||
6 | 一個或多個標準品數據點超出曲線范圍 | 標準品添加順序混亂,，或者放置于錯誤位置 | 按照說明要求重復實驗,，保證標準品添加正確。 |
標準品被污染或與其他標準品混淆 | 改用新的標準品,，按照由低濃度到高濃度的順序添加標準品 | ||
洗滌不*或者洗滌系統(tǒng)失靈 | 遵循一如既往的洗滌方式,，檢查洗滌系統(tǒng) | ||
加入標準品和試劑的時間不* | 由低到高濃度依次添加標準品，使用多道槍移液 | ||
多道槍使用不當 | 校準多道槍,，檢查吸嘴是否套緊,，確保吸液量* |
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