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一、原理

四環(huán)素類ELISA檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中四環(huán)素類的殘留量,。

二,、適用范圍

定量檢測組織、蜂蜜,、牛奶樣本中四環(huán)素類殘留,。

三、四環(huán)素類ELISA檢測試劑盒特點及技術(shù)指標(biāo)

* 檢 測 時 間 ： 40min

  試劑盒靈敏度： 0.1ppb(µg/kg)

* 試劑盒檢測純陰性樣本的背景值＜1ppb,；

* 樣品直接稀釋用于檢測,，結(jié)果準(zhǔn)確；

* 試劑盒提供近工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品,，使用更方便,。

試劑盒檢測樣本的靈敏度和準(zhǔn)確度：

試劑盒特異性：

四、所需材料

儀器：微孔板酶標(biāo)儀450 nm/630 nm,、均質(zhì)器,、振蕩器、離心機、天平（感量0.01 g）,、離心管（5 mL, 50 mL）

微量移液器：單道 1µL～10 µL,、10 µL～100µL

多道 50µL～300µL

試劑：去離子水

五、 試劑盒組成

*注：A,、B,、C、D,、E5個標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：0 ppb, 5 ppb,15 ppb, 45ppb, 135ppb,，稀釋50倍使用，現(xiàn)配現(xiàn)用,，配后避光放置并于半小時內(nèi)使用,，具體見溶液配制。

六,、溶液配制

配液1: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積比進行稀釋,，用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月,，用前一天取出回溫,。

配液2: 1×四環(huán)素樣品稀釋液

用去離子水將10×四環(huán)素樣品稀釋液按1: 9的體積比進行稀釋，用于樣本的稀釋,，1×四環(huán)素稀釋液在4℃環(huán)境可保存一個月,，用前一天取出回溫。                                                         

配液3: 1×四環(huán)素提取液

  用去離子水將10×四環(huán)素提取液按1: 9的 體積比進行稀釋,，用于樣本的提取，1×四環(huán)素提取液在室溫環(huán)境可保存一個月,。

配液4:  四環(huán)素工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品

七,、樣本前處理                                                   

樣本處理前須知：

① 處理完的樣品應(yīng)及時進行下步檢測，實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭,。② 樣本數(shù)目超過8個時推薦使用排槍加樣。

（一）蜂蜜 （原蜜,、成品蜜,，稀釋倍數(shù)：30）

① 稱取樣品1.0g ± 0.05g至7mL離心管中，加  入2mL 去離子水,，震蕩使其溶解（若渾濁需離心）,；

② 取出50μL清亮液體，加到450μL 去離子水中,，混勻,，取50μL直接用于分析。

（二）豬肉、魚蝦,、雞肉（稀釋倍數(shù)：40）

① 稱取樣品1.0g ± 0.05g至50mL離心管中,，加  入3mL  1×四環(huán)素提取液，震蕩提取2-3min,；

② 4000rpm離心5min,；

③ 取50μL上清液加到450μL1×四環(huán)素樣品稀釋液，混勻,，取50μL用于分析,。

（三）生鮮奶（稀釋倍數(shù)：1）

  取新鮮無變質(zhì)的生奶，取適量回溫后直接用于分析,。

八,、 酶標(biāo)免疫測定程序

• 將所有所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，待其*回升至室溫后方可使用,，根據(jù)體積大小不同取出回溫的時間從1小時~3小時,。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
•  按標(biāo)準(zhǔn)品和樣品雙孔平行的數(shù)量使用微孔,。
•  加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,、酶、抗體：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µL 到對應(yīng)的微孔中,，加入四環(huán)素類酶標(biāo)物50µL /孔,， 再加入四環(huán)素類抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min,。
•  洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干,，

加入洗滌工作液250 µL/孔,，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體,，重復(fù)洗滌3次,，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

•  顯色：加入底物液A液50 µL/孔,，再加底物    

液B液50 µL/孔,，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min,。

•  測定：加入終止液50µL/孔,，用酶標(biāo)儀立即  測定雙波長450/630nm吸光度值。

九,、 結(jié)果判定

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素類實際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件,，以便進行大量樣本的分析計算,。）

十、 注意事項

① 根據(jù)體積大小不同取出回溫的時間從1小時~2小時,，體積15毫升以上的先從冷藏環(huán)境取出回溫,。

② 50*四環(huán)素標(biāo)品使用完畢后請及時放回冰箱避光保存。

③ 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚,。

④不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號的試劑,。

⑤ 0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時,，表示試劑可能變質(zhì)。

⑥ 在加入底物液A液和底物液B液后,，一般顯色    時間為15min即可,。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20min,，反之則減短反應(yīng)時間,。

⑦ 底物液B液長期使用變?yōu)闇\藍色時，請放心使用,，不影響檢測結(jié)果,。

⑧ 未提及樣本請致電本公司技術(shù)服務(wù)部。

十一,、貯藏條件及保存期

    貯藏條件： 2～8℃

保 質(zhì) 期： 12個月