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離子交換柱層析分離蛋白原理詳解
1.離子交換與洗脫
所謂離子交換,，是指溶液中的某一種離子與另一種靠靜電力結(jié)合在惰性載體上的離子進(jìn)行可逆交換的過程,，即溶液中的離子結(jié)合到載體上而載體上的離子被替換下來。若惰性載體上以共價(jià)鍵結(jié)合著帶正電荷的活性基團(tuán),，則可交換陰離子,，叫陰離子交換劑；若以共價(jià)鍵結(jié)合著帶負(fù)電荷的活性基團(tuán),，則可交換陽離子,，叫陽離子交換劑。在一定的條件下,，混合物中不同蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)及電荷多少不同,，有的能與特定離子交換劑結(jié)合，有的不能結(jié)合,；能與離子交換劑結(jié)合的蛋白質(zhì)中,，結(jié)合力的大小也不一定相同,，所以，采用適當(dāng)?shù)南疵摋l件,，可以對它們進(jìn)行有效的分離,。離子交換過程可以表示如下：
■一R+Y一+x一→■一R+X一+Y一
(陰離子交換)■一R—Y++x+→■一R—X++Y+(陽離子交換)
上式中，■代表惰性載體,；R代表惰性載體上的活性基團(tuán),；Y代表平衡離子(可替換離子)；x代表蛋白質(zhì)分子,。
樣品進(jìn)入離子交換柱之前,，共價(jià)結(jié)合于惰性載體上的活性基團(tuán)大部分處于溶劑化狀態(tài)，并吸附著平衡緩沖液中帶相反電荷的離子,。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入離子交換柱后,，由于分子表面一些基團(tuán)的電荷性質(zhì)與交換劑上活性基團(tuán)的電荷性質(zhì)相反，因而會通過靜電引力結(jié)合于交換劑上,，并把其原來吸附的平衡離子取代下來,。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，它與離子交換劑的結(jié)合力取決于分子表面能夠與離子交換劑形成靜電鍵的數(shù)目,，而后者首先與分子所攜帶的電荷的數(shù)目有關(guān),，其次與蛋白質(zhì)分子的大小及電荷排列也有一定關(guān)系，因?yàn)樗鼈兣c蛋白質(zhì)分子是否易于在離子交換劑上的適當(dāng)部位形成靜電鍵有關(guān),?？偟膩碚f，蛋白質(zhì)分子與交換劑之間存在三種不同的結(jié)合狀態(tài)：①蛋白質(zhì)分子與交換劑之間的靜電鍵數(shù)目很多,，以致它們同時(shí)解離的機(jī)率等于零,。洗脫時(shí)，這部分蛋白質(zhì)由于結(jié)合緊密而停留在柱頂端,。②蛋白質(zhì)分子與交換劑之間的靜電鍵數(shù)目相對較少,，它們同時(shí)解離的機(jī)率達(dá)到某一有限值(0～1之間)。洗脫時(shí),，某一種蛋白質(zhì)分子的靜電鍵在某一時(shí)間里同時(shí)解離,，隨洗脫液向下移動(dòng)。③蛋白質(zhì)分子與交換劑之間的靜電鍵數(shù)目極少,，*不與交換劑結(jié)合,。處于這種狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子隨洗脫液的前峰移動(dòng)，呈現(xiàn)一個(gè)高而窄的“穿過峰’’(“不交換峰”),。如果混合物中有幾種蛋白質(zhì)同時(shí)處于這種狀態(tài),，那么它們會同時(shí)被洗脫下來，達(dá)不到分離目的,。采用陽離子交換劑時(shí),，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子不能結(jié)合而呈“穿過峰”洗脫下來,。
蛋白質(zhì)分子在離子交換劑上的結(jié)合狀態(tài)是隨著環(huán)境條件的變化而改變的。洗脫就是通過改變緩沖液離子強(qiáng)度或/和pH來改變蛋白質(zhì)與交換劑的結(jié)合狀態(tài),，降低其與交換劑的結(jié)合力,，使交換上去的不同蛋白質(zhì)分子以不同速度洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的,。增加緩沖液的離子強(qiáng)度時(shí),，由于洗脫液中高離子強(qiáng)度競爭性離子的存在，與交換劑結(jié)合的蛋白質(zhì)分子被取代下來進(jìn)入洗脫液中,。洗脫液中離子種類不同時(shí),，取代能力不一樣。改變緩沖液的pH時(shí),，蛋白質(zhì)分子的解離度降低,，電荷減少，從而減弱其與交換劑的結(jié)合力,。應(yīng)用陰離子交換劑時(shí)要降低pH,；應(yīng)用陽離子交換劑時(shí)要升高pH。有時(shí),，同時(shí)改變兩個(gè)方面的條件,，有利于分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。在恒定的洗脫條件下,，往往難以將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合樣品有效地分離,。通常采用不斷改變洗脫條件的方法，即用梯度洗脫的方法來分離蛋白質(zhì)混合樣品,。
雖然離子交換層析法分離蛋白質(zhì)時(shí),，主要通過離子交換的作用，但實(shí)際上也可能存在一些疏水吸附和分子篩作用,。
2.離子交換劑
人工合成的離子交換劑由高分子的不溶性基質(zhì)和許多與其共價(jià)結(jié)合的帶電荷的活性基團(tuán)組成,。由于活性基團(tuán)的電離性質(zhì)不同,，而有強(qiáng)酸性,、強(qiáng)堿性、弱酸性和弱堿性之分,。不溶性基質(zhì)主要有樹脂,、纖維素、葡聚糖凝膠,、聚丙烯酰胺凝膠和硅膠等,。
離子交換樹脂一般只適合分離小分子物質(zhì)如氨基酸等，不適合分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),，一方面是因?yàn)榇蠓肿硬灰走M(jìn)入樹脂緊密交聯(lián)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部,，另一方面是因?yàn)榻宦?lián)聚苯乙烯骨架疏水性很強(qiáng),，用于蛋白質(zhì)分離時(shí)，會出現(xiàn)疏水性的不可逆吸附,。此外,，離子交換樹脂的機(jī)械強(qiáng)度較差，而且樹脂的體積常隨著溶劑離子強(qiáng)度的變化發(fā)生溶脹和收縮,。離子交換纖維素的種類很多,，可分為陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素兩大類。由于這些材料是纖維狀的,，大部分活性基團(tuán)分布在表面,，所以，適合于分離蛋白質(zhì)等生物大分子,。二乙基氨乙基纖維素(DEAE一纖維素)和羧甲基纖維素(CM一纖維素)分別是應(yīng)用得*泛的陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素,。另外，根據(jù)纖維素顆粒的物理結(jié)構(gòu)不同,，可分為“纖維型,，，和“微晶型”兩大類,。‘‘微晶型”因顆粒細(xì),、比重大，能制成緊密的柱,，交換容量大,，分辨率高。
離子交換葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠具有許多優(yōu)點(diǎn)：不會引起被分離物質(zhì)的變性或失活,；非特異性吸附很低,；交換容量大(為離子交換纖維素的3～4倍)；容易制成微球型,，因此裝柱和層析時(shí)的流速都較易控制,。它的缺點(diǎn)是隨著洗脫液的離子強(qiáng)度和pH的變化，床體積變化大,，明顯影響流速,；另外，由于它的凝膠性質(zhì),，有時(shí)會把大分子物質(zhì)排阻在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之外,。
目前，用于蛋白質(zhì)和多肽離子交換HPLC的多為以硅膠為載體的離子交換劑,。以硅膠為載體的離子交換劑的主要優(yōu)點(diǎn)是有很好的機(jī)械強(qiáng)度,，能耐受較高的層析柱壓，可適應(yīng)廣泛種類的流動(dòng)相，在含有變性劑,、有機(jī)溶劑和高離子強(qiáng)度的洗脫液中均能使用,，不會發(fā)生明顯的溶脹與收縮，而且可以制成各種孔徑5～1000nm的剛性填料,。根據(jù)硅膠載體上鍵合的活性基團(tuán)的不同,，可分為強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性,、弱酸性和弱堿性的離子交換劑,。通常用于蛋白質(zhì)與多肽分離的強(qiáng)酸性陽離子交換劑聯(lián)有磺酸基(一S03H)；強(qiáng)堿性陰離子交換劑聯(lián)有季胺堿基[一CH2N+(CH3)3],；弱酸性陽離子交換劑聯(lián)有羧甲基(一CH2一COO一,，CM)；弱堿性陰離子交換劑聯(lián)有二乙基氨乙基[一CH2CH2N(CH2CH2)2,，DEAE],。強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性離子交換劑的優(yōu)點(diǎn)是流動(dòng)相較大范圍內(nèi)的pH不會改變載體活性基團(tuán)的帶電性質(zhì)，因而在酸性,、中性和堿性的流動(dòng)相中均能使用,。弱酸性(CM型)的離子交換劑宜在pH>4.0的環(huán)境中使用，弱堿性(DEAE型)的離子交換劑宜在pH<9.6的環(huán)境中使用,。弱酸性和弱堿性離子交換劑由于對
H+和OH一
有較大的親和力,，為洗脫和再生帶來了方便，對于一些吸附性能較強(qiáng)的蛋白質(zhì)與多肽樣品采用弱堿性和弱酸性的交換劑,，可以在較溫和的條件下,，即較低的鹽濃度和較小的pH改變的情況下把樣品洗脫下來。這對于某些蛋白質(zhì)的活性保持通常是很有意義的,。以硅膠為載體的離子交換劑可有不同顆?？讖焦┻x擇，大孔徑的填料為相對分子質(zhì)量Mr大的蛋白質(zhì)提供更多可交換的基團(tuán),，使每克交換劑的交換容量增大,。一般蛋白質(zhì)樣品應(yīng)選擇孔徑為30nm的交換劑，對于相對分子質(zhì)量Mr150000以上的蛋白質(zhì),，應(yīng)當(dāng)選擇孔徑l00nm的交換劑,。
3.離子交換柱層析條件的選擇
對于分離一個(gè)特定的蛋白質(zhì)，選擇什么樣的柱子,、離子交換劑和流動(dòng)相等需根據(jù)具體情況統(tǒng)籌考慮,，主要是根據(jù)待分離蛋白質(zhì)本身的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)確定,。因此,，在采用離子交換層析法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離之前，應(yīng)當(dāng)對待分離的蛋白質(zhì)的性質(zhì)有所了解,，如等電點(diǎn),、相對分子質(zhì)量,、疏水性、生物活性及測定方法,、溶解性,、濃度、發(fā)生聚合的可能性,、穩(wěn)定性以及微觀不均一性等,。由于多數(shù)情況下離子交換柱層析采用梯度洗脫，因而柱子都不需很長,。了解樣品的等電點(diǎn)決定選用陽離子還是陰離子交換劑以及流動(dòng)相的pH,；樣品的相對分子質(zhì)量Mr將決定選用多大孔徑的柱填料；疏水性強(qiáng)的樣品則要求選用疏水吸附較小或親水性載體的交換劑,，以防止非特異性疏水吸附,；活性測定方法可用來鑒定分離到的樣品及測定回收率；樣品的溶解性在選用流動(dòng)相的種類時(shí)是必須考慮的,，并依此決定是否要在流動(dòng)相中添加促溶劑,；根據(jù)樣品的穩(wěn)定性決定層析溫度、流動(dòng)相pH以及是否要在流動(dòng)相中添加穩(wěn)定劑,；樣品的濃度和含量是選擇柱體積大小和每次進(jìn)樣量的依據(jù),；對于那些存在微觀不均一的樣品，由于它們在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上極其相似,，所以在分離時(shí)要采用分辨率盡可能高的條件(如等梯度洗脫),；對某些樣品還要選用適當(dāng)?shù)臉悠窛舛取H和鹽濃度以防止其發(fā)生聚合,。
(1)離子交換劑的選擇在等電點(diǎn)已知的前提下,，若所用緩沖液的pH高于等電點(diǎn)，則用陰離子交換劑,；反之,，若所用緩沖液的pH低于等電點(diǎn)，則用陽離子交換劑,；若先確定了所用離子交換劑的類型,，那么，就必須對緩沖液的pH作相應(yīng)的調(diào)整,。但在實(shí)際應(yīng)用中,，為了避免樣品處于過酸或過堿的環(huán)境，對于酸性蛋白質(zhì)和多肽樣品(pI<6),，通常是使其帶有負(fù)電荷而采用陰離子交換劑,；對于堿性蛋白質(zhì)和多肽樣品(pI>8)，通常是使其帶有正電荷而采用陽離子交換劑。等電點(diǎn)未知時(shí),，可參照電泳分析的結(jié)果,。在中性和偏堿性條件下電泳時(shí)向陽極移動(dòng)較快的物質(zhì)，同樣條件下可被陰離子交換劑吸附,；向陰極移動(dòng)或向陽極移動(dòng)較慢的物質(zhì),，同樣條件下可被陽離子交換劑吸附。但有時(shí)有例外,，因?yàn)槟骋晃镔|(zhì)的層析行為,，除與分子的凈電荷有關(guān)外，還與它的分子大小,、分子結(jié)構(gòu)和電荷排列等有關(guān),。對于等電點(diǎn)未知的蛋白質(zhì)，還可用陰離子交換劑和陽離子交換劑分別在較高pH(如pH8.6)和較低pH(如pH5.5)條件下進(jìn)行離子交換實(shí)驗(yàn),，觀察交換吸附的情況,。如果待分離的物質(zhì)能被兩種交換劑吸附，則兩種離子交換劑都可用于分離,，而且待分離物質(zhì)與其他成分分離的機(jī)會更多,。如果都不吸附，則盡量降低樣品和起始緩沖液的鹽濃度,，直至幾乎為零,。若發(fā)現(xiàn)被吸附的物質(zhì)由于吸附太牢而不易洗脫，則應(yīng)選用交換當(dāng)量較小或具有弱解離活性基團(tuán)的離子交換劑,。
(2)緩沖液的選擇緩沖液離子應(yīng)不影響被分離物質(zhì)的活性并不干擾其測定,，不影響樣品的溶解度和穩(wěn)定性。如洗脫液要用280nm波長檢測時(shí),，緩沖液內(nèi)就不能有芳香族化合物,；如要用215～225nm波長檢測肽鍵的含量，則不能用含羧基的緩沖液,。采用陽離子交換劑時(shí),，應(yīng)選用陰離子型緩沖液，如磷酸,、醋酸緩沖液等,。采用陰離子交換劑時(shí)，應(yīng)選用陽離子型緩沖液,，如Tris,、吡啶緩沖液等。
緩沖液pH的確定首先取決于被分離物質(zhì)的等電點(diǎn),，采用陽離子交換劑時(shí)應(yīng)低于物質(zhì)的等電點(diǎn),，采用陰離子交換劑時(shí)應(yīng)高于物質(zhì)的等電點(diǎn),。同時(shí)要結(jié)合考慮被分離物質(zhì)的溶解度、穩(wěn)定性和離子交換劑的活性基團(tuán)的PK´,。用陰離子交換劑時(shí)pH應(yīng)低于其pK´,，用陽離子交換劑時(shí)pH應(yīng)高于其pK´,，且應(yīng)使緩沖液pH介于樣品等電點(diǎn)和pK´之間,。
為了降低鹽離子的競爭，起始緩沖液的濃度要盡可能的低(如0.01mol/L左右),。這就需要選用其pK´接近所需pH的緩沖離子,，以使緩沖液具有較強(qiáng)的緩沖能力，避免緩沖離子與離子交換劑作用而引起pH的改變,。當(dāng)確信樣品易被吸附后,，可適當(dāng)提高起始緩沖液的濃度以保證一定的緩沖能力。