微生物法

1.原理
葉酸是酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生長所必需的營養(yǎng)素,。在一定條件下,，L.C的生長繁殖與培養(yǎng)基中葉酸含量呈正比關(guān)系,，細菌增殖的量以光密度值計,，通過與標準曲線相比較,，計算出樣品中葉酸的含量,。
2.適用范圍
參考《Methods of Vitamin Assay》,，第4版,。本方法適用于各類食物中葉酸的測定,。檢測限為0.1ng,。
3.儀器與設(shè)備
（1） 恒溫培養(yǎng)箱
（2） 離心機
（3） 高壓消毒鍋
（4） 震蕩器
（5） 接種針和接種環(huán)
（6） 分光光度計
4.試劑
除特殊說明外，本實驗中所有試劑均為分析純,，水為蒸餾水,。
（1） 菌種：酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）
（2） 磷酸緩沖液（0.05mol/L, pH6.8）:稱取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。臨用前用約5g抗壞血酸調(diào)節(jié)pH至6.8,。（注：葉酸對光,、熱敏感，易被氧化破壞,，抗壞血酸有助于保護葉酸被氧化,。）
（3） 雞胰酶溶液： 稱取100mg干燥的雞胰酶（Difco公司）（注：含有葉酸軛合酶，用于水解葉酸多谷氨酸鹽）,， 加入20ml磷酸緩沖液制成勻漿,，3000rpm離心10min,取上清液備用。臨用前現(xiàn)配,。
（4） 蛋白酶-淀粉酶溶液：分別稱取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司）,，加入20ml磷酸緩沖液制成勻漿，離心3000rpm 10min,取上清液備用,。臨用前配制,。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml無水乙醇溶液，加入80ml水混勻,。
（6） 01mol/L NaOH: 稱取0.4g氫氧化鈉,，加2+8乙醇溶液溶解并稀釋至1L。
（7） 10mol/L NaOH,。稱取400g氫氧化鈉,，加水溶解并稀釋至1L。
（8） 葉酸標準儲備液（200mg/ml）：準確稱取200mg葉酸標準品（Sigma公司,，純度大于98%）,，用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。儲存于棕色瓶中,。
（9） 葉酸標準中間液（200ng/ml）：準確吸取1.0ml葉酸標準儲備液,，用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。儲存于棕色瓶中,。待標定,。
標定：準確吸取1ml葉酸標準中間液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml,。以0.1mol/L NaOH調(diào)零點,，比色杯厚度1cm，波長256nm,，測定3次紫外吸光度值,，取平均值,，按下式計算標準中間液濃度。

式中：
X1 -- 葉酸標準中間液濃度,，ng/ml,；
A -- 標準中間液平均紫外吸光度值；
E -- 摩爾消光系數(shù)24,500,；
M -- 葉酸分子量441.42,；
10-- 測定紫外吸光度值時的稀釋倍數(shù)；
106 -- 由g/L換算成ng/ml的換算系數(shù),。
（10） 葉酸標準工作液（0.2ng/ml）:準確吸取1.0ml葉酸標準中間液,，用磷酸緩沖液稀釋定容至1L。
（11） 2.4mol/L HCl：量取20ml濃鹽酸,，加水稀釋至100ml,。
（12） 酶解酪蛋白溶液：將8g碳酸氫鈉溶解于1L水中，加入60g去維生素酪蛋白（Sigma 公司）,，用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至 8.0（調(diào)pH時應(yīng)小心,，不要過堿后再加酸反復(fù)調(diào)節(jié)，避免酪蛋白結(jié)塊）,。加入300mg胰酶,，攪拌20min，使胰酶混勻充分,。再加入2.5ml甲苯,，置37℃恒溫箱酶解48～72h（此步驟是將酪蛋白酶解為L.C可以利用的小分子肽。酶解時間不易超過72h,，如時間過長，配成的培養(yǎng)基不利于細菌生長）,。將酪蛋白液從恒溫箱中取出,，121℃高壓30min以終止反應(yīng)并去除甲苯。冷卻,，加10g硅藻土攪拌,，用墊有濾紙的布氏漏斗過濾。向濾液中加入約60ml冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.7,。稱取活性炭12g,，加入濾液中攪拌10min，用布氏漏斗過濾,，重復(fù)三次,。每次過濾時，布氏漏斗內(nèi)加有10g硅藻土協(xié)助過濾,。后濾液用水稀釋至1200ml,，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的葉酸以減少試劑空白,，同時也可吸附肽及氨基酸，應(yīng)注意控制攪拌時間）,。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已稱重的蒸發(fā)皿中,，沸水浴蒸發(fā)至干。將蒸發(fā)皿置于100℃恒溫烤箱內(nèi)干燥至恒重,，在干燥器中冷卻至室溫,。稱量蒸發(fā)皿的重量，蒸發(fā)皿內(nèi)固體重量,，如固體重量小于400mg,，即每毫升酪蛋白溶液中固體含量<40mg，則棄除酪蛋白液,，重新制備,。
（13） 黃嘌呤溶液：取0.4g黃嘌呤，加入10ml氨水,，加熱溶解,，用水稀釋至100ml。冰箱保存,。
（14） 腺嘌呤-鳥嘌呤-尿嘧啶：分別稱取硫酸腺嘌呤,，鹽酸鳥嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml,，加熱溶解,，用水稀釋至100ml，室溫貯存,。
（15） 乙酸緩沖液（1.7mol/L,pH4.5）：38.65g無水乙酸鈉,，19.8ml冰乙酸，加水稀釋至500ml,。
（16） 維生素溶液：取10mg核黃素溶解于40 ml乙酸緩沖液中,。取0.2mg生物素，2.5mg NaHCO3,，20mg對氨基苯甲酸,，40mg鹽酸吡多醇，4mg鹽酸硫胺素,，8mg泛酸鈣,，8mg尼克酸溶解于50ml水中。將上述兩種溶液混合,，加水至100ml,。
（17） 吐溫-80溶液：將2g吐溫-80加入100ml 45℃水中，混勻,。
（18） 還原型谷胱甘肽溶液：取0.1g還原型谷胱甘肽,，加水至100ml.
（19） 甲鹽溶液：稱取5g磷酸氫二鉀和2g磷酸二氫鉀,，加水溶解至100ml，液面上加入少許甲苯保存,。
（20） 乙鹽溶液：稱取2 g硫酸鎂,，0.5 g硫酸亞鐵和0.5 g硫酸錳，加水至100 ml,，液面上加少許甲苯保存,。
（21） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按下表配制，終定容至500ml,。

加水至250 ml,，攪拌，用10mol/LnaOH溶液調(diào)節(jié)pH 6.8±0.1,，然后加入乙鹽溶液2.5 ml,，磷酸緩沖液200 ml,用水補至500 ml。4℃冰箱內(nèi)可保存一周 ,。
（甲,、乙鹽混合后易產(chǎn)生沉淀，所以配培養(yǎng)基時不可同時加入,，加入甲鹽后先調(diào)節(jié)pH再加入乙鹽,。基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可直接選購DIFCO公司生產(chǎn)的葉酸測定用培養(yǎng)基）
（22） 瓊脂培養(yǎng)基：

加水至100 ml,，置水浴煮至瓊脂熔化,，調(diào)節(jié)pH 6.8±0.1。盡快倒入試管中,，每管3～5 ml,，塞上棉塞，121℃高壓滅菌15 min,取出后直立試管,，冷卻至室溫.于冰箱內(nèi)保存,。
5.菌種制備與保存
（1） 儲備菌種的制備：將L.C純菌種轉(zhuǎn)接至2個或多個瓊脂培養(yǎng)基管中。37 ℃±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h,。貯于冰箱內(nèi)，每周轉(zhuǎn)種一次留作儲備菌種,。
（2） 種子培養(yǎng)液的制備：取2 ml葉酸標準使用液和10 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，混勻，分裝至4支5 ml離心管中,，塞上棉塞,，121℃高壓滅菌15 min，實驗時現(xiàn)制,。
6.操作步驟
所有操作均需避光進行
6.1 樣品制備
（1） 強化劑型樣品：稱取0.1～0.5 g樣品（約含葉酸100～300 ng）于100 ml錐形瓶中,，加入50 ml磷酸緩沖液,，混勻。121℃高壓水解15 min,。定容至100ml,，過濾。
（2） 果蔬類：稱取樣品0.2～2 g（約含葉酸100～300 ng）,，加磷酸緩沖液經(jīng)高壓水解后過濾,，殘渣用同樣緩沖液再次高壓，過濾,。合并兩次濾液,，定容至100ml。
（3） 谷,、肉,、蛋、魚,、豆,、奶類等富含淀粉和/或蛋白類樣品：稱取樣品0.1-2 g（約含葉酸100～300 ng），加磷酸緩沖液高壓水解后,， 冷卻,。加入1 ml雞胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉酶液，1 ml甲苯,，充分混合,，置于37 ℃±0.5 ℃恒溫箱內(nèi)酶解16～20h。酶解后定容至100ml過濾,。另取一支試管,，加入1 ml雞胰酶，1 ml蛋白酶-淀粉酶和磷酸緩沖液,，作酶空白,。
（4） 口服液、飲料,、果汁等樣品：稱取樣品0.5～2 ml（約含葉酸100～300 ng）,，加磷酸緩沖液高壓水解后， 冷卻,，加入1ml雞胰酶,，1 ml甲苯，充分混合,，置于37 ℃±0.5 ℃恒溫箱內(nèi)酶解16～20 h,。酶解后定容至100ml，過濾。另取一支試管,，加入1 ml雞胰酶和磷酸緩沖液,，作酶空白。
6.2根據(jù)樣品葉酸含量,，將上述濾液用磷酸緩沖液稀釋到一定倍數(shù),，使葉酸終濃度為0.1～0.4 ng/ml。
6.3樣品管的制備：取4支試管,，每支試管中分別加入稀釋后樣品液1.0,、2.0、3.0,、4.0 ml,，補充水至體積為5.0 ml，加入5 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，混勻,。同樣制作酶空白管。
6.4 滅菌：將以上標準系列管,、樣品管和酶空白管全部塞上棉塞,，121℃高壓滅菌15 min。
6.5 標準系列管的制備：取試管分別加入葉酸標準工作液0.0,、0.5,、1.0、2.0,、3.0,、4.0、5.0ml,相當(dāng)于葉酸含量0,，0.1,，0.2，0.4,，0.6,，0.8，1.0 ng,，加水補至體積為5.0 ml,，再加5 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻,。如樣品管一樣進行滅菌,。標準系列管進行平行測定。
6.6 接種
（1） 接種液的制備：接種前一天,，用滅菌的接種針將菌種由儲備菌種管中轉(zhuǎn)種至2支已滅菌的種子培養(yǎng)液中，37℃±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h,?；鞈曳N子培養(yǎng)液,，無菌操作下用接種針管將20滴種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至另2支無菌的種子培養(yǎng)液中，37 ℃±0.5 ℃再培養(yǎng)6h,。震蕩混勻,，制成菌種混懸液。立即使用,。（葉酸是L.C生長所必需的,，但是如果培養(yǎng)基中葉酸含量過高，細菌可在體內(nèi)貯存,，使測定空白值,，影響細菌生長曲線。將接種液轉(zhuǎn)種再培養(yǎng)6h,，有利于消耗細菌體內(nèi)貯存的葉酸,。）
（2） 接種：在無菌操作條件下向每支已滅菌的標準系列管、樣品管和酶空白管接種一滴上述接種液（注意應(yīng)直接滴在培養(yǎng)基內(nèi)）,，混勻,。留一支標準0管不接種，用于測定光密度時調(diào)零,。
6.7 培養(yǎng)：置于37 ℃±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～40 h,。
6.8 測定：用分光光度計，在波長540 nm下,，以未接種的標準0管調(diào)節(jié)零點,，測定標準管、樣品管和酶空白管的光密度值,。
7.計算
（1） 繪制標準曲線：以標準系列管中葉酸含量為橫坐標,，光密度值為縱坐標，繪制葉酸標準曲線,。
（2） 結(jié)果計算：根據(jù)樣品管和酶空白管的光密度值,，從標準曲線上查得相應(yīng)的葉酸含量，按下式計算,。

式中：
X--樣品中葉酸含量,，μg/100g；
c--從標準曲線上查得樣品測定管中葉酸含量,，ng,；
P--從標準曲線上查得酶空白管中葉酸含量，ng,；
V1--樣品制備時定容體積,，ml；
F--稀釋倍數(shù)；
V2--制備樣品測定管時加入的樣品液體積,，ml,；
m--樣品質(zhì)量，g,；
100/1000──樣品含量由ng/g換算成μg/100g的系數(shù),。
8.注意事項
（1） 同一實驗室平行測定或重復(fù)測定結(jié)果相對偏差值<10%。
（2） 微生物法的測定結(jié)果為總?cè)~酸含量,。
（3） 微生物法測定葉酸常用的菌種除L.C外還有糞鏈球菌（Streptococcus faecalis, S.F. ATCC 8043）,。用L.C測定靈敏度高，用S.F.測定重現(xiàn)性好,。本方法選用L.C,，實驗條件以適宜酪乳酸桿菌的生長條件而定。
（4） 常用的酪蛋白處理方法有酶水解法,、酸水解法和堿水解法,，由于葉酸在堿性條件下相對穩(wěn)定，所以用堿處理酪蛋白不能破壞葉酸,，使培養(yǎng)基中葉酸含量偏高,，標準空白值高，線性差,。酸水解法和酶水解法均可有效去除葉酸,，降解蛋白，使細菌生長曲線在0～1ng范圍內(nèi)線性良好,，其中實驗證明酶水解法更好,。
（5） 培養(yǎng)基的pH對細菌生長很重要，pH6.8～7.2,，生長曲線佳,。PH過低或過高均不利于細菌生長。
（6） 本方法配制的培養(yǎng)基和Difico公司的葉酸培養(yǎng)基比較,，標準曲線線性基本一致,，對樣品檢測結(jié)果基本一致。
（7） 食物中葉酸多以多谷氨酸鹽形式存在,，而L.C只能利用葉酸單,、雙、三谷氨酸鹽,，所以對天然食品處理時先用軛合酶對葉酸進行降解,。常用的軛合酶來源有血漿、雞胰酶和豬腎酶,。豬腎酶需從市售豬腎中提取,，操作復(fù)雜,，提取后對酶的堅定相對困難，且重復(fù)性差,，酶的用量難于控制,。雞胰酶可從Difco公司購買，可直接使用,，重復(fù)性好。雞胰酶的用量與葉酸測定結(jié)果相關(guān),，以往報告中認為水解200ng葉酸需加入0.5～1mg雞胰酶,。也有人認為在pH7.0的環(huán)境下增加酶的用量可提高葉酸水解率。本實驗室認為水解200 ng 葉酸,，雞胰酶用量宜控制在3～5mg左右,，過高可降低水解效果。
（8） 軛合酶在應(yīng)用中也有其局限性,。天然食物中往往也含有軛合酶,，在食物貯藏、運輸過程中葉酸衍生物之間可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化,，使外源性軛合酶作用下降,；并且蔬菜水果存在一些酶的干擾物質(zhì)也影響酶的活性，如檸檬酸,、鞣酸等,。所以測定中樣品需注意保鮮，及時測定,；樣品處理方法也應(yīng)視樣品性質(zhì)而定,。
（9） 蛋白酶、淀粉酶的應(yīng)用可將包裹于蛋白,、淀粉之間或與蛋白結(jié)合的葉酸釋放,，有助于樣品檢測。蛋白酶,、淀粉酶,、雞胰酶聯(lián)合應(yīng)用，水解效力大于3酶效力之和,。