Actin-肌動蛋白是細胞骨架*的一個組成部分，其在很多基礎的細胞活動中扮演著非常重要的角色,。尤其在細胞形態(tài),，遷移和研究細胞機制中,，肌動蛋白都是一個非常理想的觀測蛋白。肌動蛋白是由小球狀的G-actin聚合成絲狀的F-actin動態(tài)交互變化構成的,，從而參與了細胞活動中的各種細胞骨架的變化。通常研究活細胞中actin的活動用的是轉染actin-GFP融合蛋白的質粒,，可以同時標記F-actin和G-actin，可以有效的反映出細胞骨架的相對活性,，但是當值需要觀測F-actin的時候，使用actin-GFP會降低信噪比,，難以專一捕捉F-actin的活動,。更有研究顯示，使用actin-GFP會直接影響細胞遷移和細胞分裂中的肌動蛋白活性,。

2015年英國的科研人員研究了幾種可以標記F-actin染料發(fā)現(xiàn)LifeAct是一種觀測F-actin非常理想的染料,，其能特異性結合F-actin而不會影響肌動蛋白的活性,，能夠很好的顯現(xiàn)出肌動蛋白的結構。LifeAct是一個17個氨基酸形成短肽,，由于其很小,，不會被哺乳動物細胞當作外來蛋白清除，從而使一個非常理想的F-actin標記物,。文中，以人間充質干細胞（hMSCs,， Human mesenchymal stem cells）為載體,，研究LifeAct-GFP對比actin-GFP在觀測肌動蛋白中的應用。

Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration

K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight

Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034

（一）實驗材料

• 細胞:     hMSCs            （STEMCELL Technologies，UK）
• 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質粒    （ibidi,， Germany）

             DMEM             （Gibco）

             Actin-GFP

             Lipofetamine LTX Plus     (Invitrogen)

             4%多聚甲醛溶液

             0.5%Triton X-100

  3) 耗材：玻璃管（外徑1mm,，內(nèi)徑0.58mm）

（二）實驗步驟

  1,、LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染

• 使用未分化的hMSCs細胞轉染actin-GFP質粒。
• 無抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培養(yǎng)細胞30min到1h
• 使用Lipofetamine LTX Plus轉染質粒,，按照說明書將細胞在轉染培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時。
• 使用未分化的hMSCs細胞和,，hMSCs細胞分化的永生化軟骨細胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺病毒,。

2、固定細胞的肌動蛋白結構

使用Alexa Flour555-phalloidin標記F-actin

• 單層細胞貼壁染色,，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染的細胞,，用4%多聚甲醛固定10分鐘,，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘,。
• 懸浮細胞染色,，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染的細胞消化為單細胞，再在懸浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分鐘,，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘,。

3、微管吸吮技術

• 將外徑1mm,，內(nèi)徑0.58mm玻璃管拉為內(nèi)徑7-8μm的微管
• 使用注射泵維持微管內(nèi)有0.76kPa的負壓
• 輕輕吸取細胞,，每2秒采集一張圖片
• 細胞在微管負壓情況下會有不規(guī)則的突起，進入微管,，能很好的觀測F-actin的活動,。

• 實驗結果

1、鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染共定位（圖一）

圖一：鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染共定位：A,、E）貼壁細胞中,，LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在標記F-actin時都表現(xiàn)很好，但是在懸浮細胞中,，C,、G）雖然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼筆環(huán)肽都能共定位F-actin，但是actin-GFP在整個細胞中都有染色,，因為其同時染G-actin沒有凸顯出F-actin,。

2、微管吸吮技術使細胞發(fā)生形變,，觀察F-actin活動（圖二）

圖二：微管吸吮技術造成細胞形變,。A）LifeAct-GFP可以很好的追蹤F-actin，會根據(jù)細胞的形變,，標記到細胞突起的外緣的骨架；B）使用Actin-GFP標記沒有特異性,，不能看到細胞變形中邊緣的骨架。