很多童學(xué)做共聚焦成像的時候都會遇到細胞貼壁難的問題。今天分享下如何處理玻璃底培養(yǎng)皿,、如何選擇玻璃底培養(yǎng)皿,，讓細胞妥妥地貼壁,，大家做共聚焦時候能夠更得心應(yīng)手,。

   市面上常見的玻璃底培養(yǎng)皿，通常是在塑料培養(yǎng)皿底部打個洞,，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養(yǎng)皿底部,。并不是整個培養(yǎng)皿的底部都是玻璃材質(zhì)的。適用于觀測的區(qū)域僅僅在打孔的區(qū)域,。但是由于玻璃的疏水性,，往往在培養(yǎng)細胞的時候，細胞不能在玻璃上很好地貼壁,，生長狀態(tài)并不好,，甚至在做共聚焦掃描成像的時候發(fā)生細胞脫片的現(xiàn)象。

圖1  市面常見玻璃底培養(yǎng)皿

    想要細胞好好貼壁,，所使用的玻璃底培養(yǎng)皿進行細胞培養(yǎng)之前,，要確認已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑。

自己動手包被

     培養(yǎng)不同的細胞,，需要的包被試劑也不同,。同時，因為用于包被的蛋白是生物產(chǎn)物,，所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的,，本技術(shù)帖只是提供參考，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說明書,。并且好以自己所用的試劑先做一個梯度實驗,，找出適合的包被濃度。

     這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL,，sigma,，P4832, 100μg/ml）：

   PLL包被適用于絕大多數(shù)細胞，尤其適用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的培養(yǎng),。在使用時需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達到理想的量,。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2。需要根據(jù)包被面積,，包被體積，來計算所需要蛋白質(zhì)的量,。

    比如：35mm玻璃底培養(yǎng)皿,，細胞生長面積是3.5cm2，包被面積是4.1cm2，包被液體積是400μl,，那根據(jù)推薦用量2μg/cm2,。那么單孔中需要8.2μg的PLL，如果只加入400μl的PLL溶液,，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）,。所以，需要用超純水將原液進行稀釋,。

具體步驟：

1. 使用超純水按照1:5稀釋PLL原液,。
2. 在每個35mm玻璃底培養(yǎng)皿中加入400μl的PLL稀釋液。
3. 室溫孵育1-2小時,，吸出PLL稀釋液,。
4. 使用2ml PBS溶液或無血清培養(yǎng)基小心的清洗3次，吸盡清洗液,。
5. 直接加入細胞懸液進行培養(yǎng),。

方法評價

    由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同，不同的包被蛋白使用方法也不一樣,。經(jīng)常由于需要對玻璃底培養(yǎng)皿包被,，而產(chǎn)生了新的污染。而且污染往往是開始養(yǎng)細胞了以后才會發(fā)現(xiàn),，這樣不僅耽誤了時間,，而且也浪費了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養(yǎng)皿價格也是不菲的（質(zhì)量不過關(guān)的玻璃底培養(yǎng)皿有可能會因為膠水沒有粘勻而漏液或者使用的膠水對細胞有毒性）,。

無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿

      對于想節(jié)省時間和功夫的童鞋,，還是直接使用無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿更為方便些。

     選擇合適的培養(yǎng)皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細胞貼壁,、培養(yǎng)皿的光學(xué)特性是否符合共聚焦要求,。

     能符合上述因素要求的培養(yǎng)皿，不局限于帶包被的玻璃底培養(yǎng)皿,，事實上,，大家都知道塑料培養(yǎng)皿更便宜、相對玻璃來說,，也更容易讓細胞貼壁,。這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例，說一下符合共聚焦實驗的培養(yǎng)皿需要具備哪些參數(shù)：

圖2  德國ibidi共聚焦培養(yǎng)皿和高質(zhì)量玻璃底培養(yǎng)皿的底部參數(shù)對比

      可以看出,，符合直接使用要求的共聚焦培養(yǎng)皿,，它們的物理參數(shù)都是非常接近玻璃的，但同時,，它們又還具有親水的特性,，能讓大多數(shù)細胞更好貼壁,；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好。比如這里舉例的ibidi培養(yǎng)皿,，就可讓絕大多數(shù)細胞系和原代細胞直接貼壁生長,，而且不易碎，算是不錯的選擇,。

   大家也可根據(jù)自己具體實驗要求,，結(jié)合上述表格的參數(shù)，找到合適自己實驗的共聚焦培養(yǎng)皿,。

方法評價

     選擇這類培養(yǎng)皿,，不需要額外包被，大大減少了污染的風(fēng)險,。并且由于塑料底部比較易于加工,，不需要膠水就能使其固定在培養(yǎng)皿底部。杜絕了漏液或者細胞毒性的可能,。

高通量共聚焦實驗耗材

  由于單個培養(yǎng)皿通量很小,，如果一次要做多個樣品，操作就會比較麻煩,，且試劑用量會較大,，這時候可以選擇多孔的耗材，比如腔室載玻片（2/4/8孔）,，可以滿足研究人員需要一次進行多通量的成像,。并且相對于傳統(tǒng)的共聚焦培養(yǎng)皿，腔室載玻片需要試劑的更少,，非常節(jié)約價格昂貴的抗體,，單孔實驗的成本大大降低。

圖3 市面的無需包被共聚焦培養(yǎng)皿和腔室載玻片

（圖片引用自德國ibidi的81156,，80826）

      現(xiàn)在也有適用于高內(nèi)涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板,。適合全自動成像和操作。

圖4  市面的高內(nèi)涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板

（圖片引用自德國ibidi的82406,，89626,；這個多孔板的壁是黑色的，可以避免成像時候孔間熒光的影響,，不錯的設(shè)計,。贊一個～）

＊文中圖片皆來自網(wǎng)絡(luò)，如侵權(quán)請刪除,。