很多童學(xué)做共聚焦成像的時(shí)候都會(huì)遇到細(xì)胞貼壁難的問題,。今天分享下如何處理玻璃底培養(yǎng)皿,、如何選擇玻璃底培養(yǎng)皿,，讓細(xì)胞妥妥地貼壁,，大家做共聚焦時(shí)候能夠更得心應(yīng)手,。

   市面上常見的玻璃底培養(yǎng)皿,，通常是在塑料培養(yǎng)皿底部打個(gè)洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細(xì)胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養(yǎng)皿底部,。并不是整個(gè)培養(yǎng)皿的底部都是玻璃材質(zhì)的,。適用于觀測(cè)的區(qū)域僅僅在打孔的區(qū)域。但是由于玻璃的疏水性,，往往在培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候,，細(xì)胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長(zhǎng)狀態(tài)并不好,，甚至在做共聚焦掃描成像的時(shí)候發(fā)生細(xì)胞脫片的現(xiàn)象,。

圖1  市面常見玻璃底培養(yǎng)皿

    想要細(xì)胞好好貼壁，所使用的玻璃底培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)之前,，要確認(rèn)已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑,。

自己動(dòng)手包被

     培養(yǎng)不同的細(xì)胞，需要的包被試劑也不同。同時(shí),，因?yàn)?/span>用于包被的蛋白是生物產(chǎn)物,，所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的，本技術(shù)帖只是提供參考,，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說明書,。并且好以自己所用的試劑先做一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，找出適合的包被濃度,。

     這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL,，sigma，P4832, 100μg/ml）：

   PLL包被適用于絕大多數(shù)細(xì)胞,，尤其適用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的培養(yǎng),。在使用時(shí)需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達(dá)到理想的量。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2,。需要根據(jù)包被面積,，包被體積，來計(jì)算所需要蛋白質(zhì)的量,。

    比如：35mm玻璃底培養(yǎng)皿,，細(xì)胞生長(zhǎng)面積是3.5cm2，包被面積是4.1cm2,，包被液體積是400μl,，那根據(jù)推薦用量2μg/cm2。那么單孔中需要8.2μg的PLL,，如果只加入400μl的PLL溶液,，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）。所以,，需要用超純水將原液進(jìn)行稀釋,。

具體步驟：

1. 使用超純水按照1:5稀釋PLL原液。
2. 在每個(gè)35mm玻璃底培養(yǎng)皿中加入400μl的PLL稀釋液,。
3. 室溫孵育1-2小時(shí),，吸出PLL稀釋液。
4. 使用2ml PBS溶液或無血清培養(yǎng)基小心的清洗3次,，吸盡清洗液,。
5. 直接加入細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)。

方法評(píng)價(jià)

    由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同,，不同的包被蛋白使用方法也不一樣,。經(jīng)常由于需要對(duì)玻璃底培養(yǎng)皿包被，而產(chǎn)生了新的污染,。而且污染往往是開始養(yǎng)細(xì)胞了以后才會(huì)發(fā)現(xiàn),，這樣不僅耽誤了時(shí)間,，而且也浪費(fèi)了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養(yǎng)皿價(jià)格也是不菲的（質(zhì)量不過關(guān)的玻璃底培養(yǎng)皿有可能會(huì)因?yàn)槟z水沒有粘勻而漏液或者使用的膠水對(duì)細(xì)胞有毒性）,。

無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿

      對(duì)于想節(jié)省時(shí)間和功夫的童鞋,，還是直接使用無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿更為方便些。

     選擇合適的培養(yǎng)皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細(xì)胞貼壁,、培養(yǎng)皿的光學(xué)特性是否符合共聚焦要求,。

     能符合上述因素要求的培養(yǎng)皿，不局限于帶包被的玻璃底培養(yǎng)皿,，事實(shí)上,，大家都知道塑料培養(yǎng)皿更便宜、相對(duì)玻璃來說,，也更容易讓細(xì)胞貼壁,。這里以德國(guó)ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例，說一下符合共聚焦實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)皿需要具備哪些參數(shù)：

圖2  德國(guó)ibidi共聚焦培養(yǎng)皿和高質(zhì)量玻璃底培養(yǎng)皿的底部參數(shù)對(duì)比

      可以看出,，符合直接使用要求的共聚焦培養(yǎng)皿，它們的物理參數(shù)都是非常接近玻璃的,，但同時(shí),，它們又還具有親水的特性，能讓大多數(shù)細(xì)胞更好貼壁,；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好,。比如這里舉例的ibidi培養(yǎng)皿，就可讓絕大多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞直接貼壁生長(zhǎng),，而且不易碎,，算是不錯(cuò)的選擇。

   大家也可根據(jù)自己具體實(shí)驗(yàn)要求,，結(jié)合上述表格的參數(shù),，找到合適自己實(shí)驗(yàn)的共聚焦培養(yǎng)皿。

方法評(píng)價(jià)

     選擇這類培養(yǎng)皿,，不需要額外包被,，大大減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)。并且由于塑料底部比較易于加工,，不需要膠水就能使其固定在培養(yǎng)皿底部,。杜絕了漏液或者細(xì)胞毒性的可能。

高通量共聚焦實(shí)驗(yàn)耗材

  由于單個(gè)培養(yǎng)皿通量很小,，如果一次要做多個(gè)樣品,，操作就會(huì)比較麻煩，且試劑用量會(huì)較大,，這時(shí)候可以選擇多孔的耗材,，比如腔室載玻片（2/4/8孔）,，可以滿足研究人員需要一次進(jìn)行多通量的成像。并且相對(duì)于傳統(tǒng)的共聚焦培養(yǎng)皿,，腔室載玻片需要試劑的更少,，非常節(jié)約價(jià)格昂貴的抗體，單孔實(shí)驗(yàn)的成本大大降低,。

圖3 市面的無需包被共聚焦培養(yǎng)皿和腔室載玻片

（圖片引用自德國(guó)ibidi的81156,，80826）

      現(xiàn)在也有適用于高內(nèi)涵顯微鏡和活細(xì)胞工作站的多孔板。適合全自動(dòng)成像和操作,。

圖4  市面的高內(nèi)涵顯微鏡和活細(xì)胞工作站的多孔板

（圖片引用自德國(guó)ibidi的82406,，89626；這個(gè)多孔板的壁是黑色的,，可以避免成像時(shí)候孔間熒光的影響,，不錯(cuò)的設(shè)計(jì)。贊一個(gè)～）

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