激光共聚焦實驗的樣品準備方法對比

——無需細胞爬片的樣品準備新方法 VS 傳統(tǒng)方法

    激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)已經(jīng)標記好的蛋白質(zhì)和分子,，為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測方法。如今,，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個非常常規(guī)的實驗操作，應(yīng)用于生物學(xué)各個研究領(lǐng)域中,。

  在細胞實驗中,，如果要進行一次激光共聚焦成像，除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數(shù)設(shè)置和操作以外，樣品的準備也是非常重要的一環(huán),。

傳統(tǒng)方法

   由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求,，普通的培養(yǎng)皿,，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像,。

1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體。但是使用蓋玻片,，在實驗操作上是非常麻煩的,，如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌,，才能開始使用,。

2.進口的細胞爬片，雖然不需要清洗,，但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長,。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞,，熒光染色后,，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上,，再進行成像,。如圖一所示：

圖一：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖。

操作流程：

1. 蓋玻片需用濃硫酸浸泡第二天,，第二天用自來水沖洗20遍,，置于無水乙醇中6小時，后用三蒸水沖洗3遍,，再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干,，消毒，再烘干后放入超凈臺備用,。
2. 準備好的蓋玻片或者專業(yè)的細胞爬片需要根據(jù)細胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被,。
3. 培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合,，這樣才能避免長成雙層細胞,。
4. 常規(guī)免疫熒光操作后，取出爬片,。準備載玻片一張,，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過來,，蓋在封片劑上,，再用指甲油封片進行成像。
5. 在激光共聚焦成像之前，好用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態(tài)和成像效果,，再去做激光共聚焦,，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

無需爬片的新方法

    這里要介紹的新方法,，大大簡化了樣品準備流程,，需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿，這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例（81156,，德國ibidi）進行說明,。共聚焦培養(yǎng)皿的底部是聚合物材質(zhì)，具有親水表面,，讓大多數(shù)種類的細胞都可以直接貼壁,，無需另外進行包被；同時,，它們的底部符合蓋玻片標準——只有180µm的厚度,，在折射率，阿貝系數(shù)上,，它們的性能和標準爬片一致,，再加上極低的自發(fā)熒光和細胞可以直接貼壁的特性，使它們成為共聚焦成像的培養(yǎng)皿,。

  所有的操作都在培養(yǎng)皿中進行,，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌,，包被程序（流程如圖二所示）

圖二：共聚焦培養(yǎng)皿的準備樣品流程,，可以直接進行細胞培養(yǎng)－染色－成像操作（圖中為德國ibidi 81156培養(yǎng)皿）

操作流程

1. 在超凈臺中打開共聚焦培養(yǎng)皿的滅菌包裝，拿出培養(yǎng)皿,，加入細胞懸液,，蓋上皿蓋，放入培養(yǎng)箱中靜置,，等待細胞貼壁,。常規(guī)細胞培養(yǎng)，待細胞長置合適密度再取出,，進行免疫熒光染色,。
2. 吸出培養(yǎng)基，以PBS清洗細胞,，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞,。
3. 20分鐘后，吸出固定液,，加入0.1%Triton X-100
4. 10分鐘后,，吸出Triton,，清洗細胞后加入BSA封閉。
5. 加入抗體熒光染色后,，吸出所有試劑,，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像,。

   使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長,，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋,，可以減少揮發(fā),；比如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿，有個巧妙的鎖扣設(shè)計,，可以扣緊培養(yǎng)皿，保證在共聚焦成像的過程中,，皿中的液體不會揮發(fā)(圖三）,。

圖三：ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計

方法優(yōu)勢總結(jié)

1.一個培養(yǎng)皿完成細胞培養(yǎng)－染色－成像等系列操作，無需包被,，無需爬片,，操作簡便；

2.在培養(yǎng)皿里的操作對于操作技術(shù)的要求相對更低,，也更便捷,；

3.培養(yǎng)皿可使用皿蓋減少蒸發(fā)，杜絕揮發(fā)對成像的影響,。