細胞趨化實驗新方法（二）--實時觀察細胞動態(tài)

案例：細胞作為趨化因子

上篇ibidi細胞趨化應用中（見鏈接：   ）以Dendritic cell對CCL19細胞趨化反應為例介紹了細胞趨化的新方法,。

本案例將介紹如何用細胞作為細胞運動的化學趨化因子。

如圖所示：觀測通道中可以使用貼壁細胞,，或者是3D培養(yǎng)的細胞,。用于趨化的細胞可以直接注入其中一個儲液池中（圖一）。

圖一：A待觀察細胞為貼壁細胞,，受到左邊的儲液池中細胞影響具有了趨化行為,。B待觀察細胞為3D培養(yǎng)細胞，在基質膠中同樣也受到了儲液池中的細胞的影響具有趨化行為,。

一,、實驗材料準備：

1. 儀器：

• 細胞培養(yǎng)箱（高濕度，37℃,，5%CO2）
• 倒置顯微鏡,，具有10X相差物鏡和定時拍照功能
• 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
• 可選配置：全自動載物臺,，自動對焦系統(tǒng)
• 分析軟件：可選用手動分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊,，或全自動的ibidi提供的WimTaxis進行細胞軌跡追蹤。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,。

1. 實驗材料準備：

實驗前一天準備工作：

為了減少ibidi細胞趨化載玻片與培養(yǎng)基中的氣泡,，將載玻片和培養(yǎng)基提前24小時放入培養(yǎng)箱中

                                 表三：制備1.6mg/ml 基質膠

操作步驟：

• 使用表一中的培養(yǎng)基制備  9 x 106 cells/ml 的細胞懸液
• 在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號試劑，避免產(chǎn)生氣泡
• 在另一1.5ml離心管中準備150 μl  collagen I
• 使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
• 小心混勻（圖一B）,，避免產(chǎn)生氣泡
• 加入90μl細胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
• 小心混勻（圖一D）,，避免產(chǎn)生氣泡

圖一：制備細胞-基質膠混合液圖示，注意：1）避免產(chǎn)生氣泡,，氣泡會破壞膠原纖維,，不能使用Vortex；2）膠原混合后,，離膠凝大約有5分鐘時間,，如果在凝膠后再進行操作會破壞膠原纖維；3）當剛加10x MEM到NaHCO3中的時候會看到顏色變化,，這表明沒有充分反應,，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

1. 細胞趨化實驗

1. 趨化試劑

• 細胞趨化物：作為趨化因子的細胞    1-5 x 105 cells/ml   
• 培養(yǎng)基：建議使用同一種培養(yǎng)基,，并且需要優(yōu)化一下血清濃度,，建議使用低濃度的血清,，減少由于血清造成的生長因子而減弱了趨化造成的影響。

1. 實驗步驟

開始細胞實驗之前,，要準備一個濕盒將細胞趨化載玻片放在濕盒中,?？梢杂靡粋€放了浸濕的紙巾的10cm培養(yǎng)皿作為濕盒（如圖二）,。

貼壁細胞準備：

• 如圖，用小塞子將C,、D,、E、F塞緊,。使用20μl的槍頭從A中加入6μl細胞懸液,。并使用同一個槍頭立即從B孔向外吸。直到觀測通道被細胞懸液充滿,。
• 在注液孔中加入培養(yǎng)基到圖示位置（圖三(B)）,。移走所有小塞子。將載玻片放在培養(yǎng)箱中等待細胞貼壁,。

圖三：(A)示意向觀測通道中加入帶觀測細胞懸液,。(B)圖表示注液孔的切面圖。

• 1-5小時后,，用顯微鏡檢查細胞是否貼壁,，如果貼壁，需要更換培養(yǎng)基,。用小塞子將C,、D、E,、F塞緊,。從A中加入10μl新鮮培養(yǎng)基。注意不要加入氣泡,。同樣用同一個槍頭從B向外吸,。
• 重復三次。
• 在注液孔中加入培養(yǎng)基到圖示位置（圖三(B)）,。移走所有小塞子,，將A、B孔塞緊,，準備開始趨化實驗,。

圖四：細胞貼壁后用無細胞培養(yǎng)基更換觀測通道中的培養(yǎng)基。

3D細胞準備

• 如圖,，用小塞子將C,、D,、E、F塞緊,。使用20μl的槍頭從A中加入6μl細胞-基質膠混合液,。并使用同一個槍頭立即從B孔向外吸。直到觀測通道被細胞-基質膠混合液充滿,。
• 在注液孔中加入基質膠到圖示位置（圖五(C)）,。移走所有小塞子。小心將A,、B孔塞緊,，將載玻片放在培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠凝固后開始趨化實驗,。

圖五：(A)向觀測通道加入細胞-基質膠混合液,。(B)用同一個槍頭從另一個孔中向外細。(C)注液孔切面圖,。(D)將A,、B口塞緊，開始趨化實驗,。

加入趨化細胞：

• 細胞貼壁或膠凝固后,，將C、D兩個孔用塞子塞緊,。從E中加入65μl新鮮培養(yǎng)基,，充滿整個儲液池。（圖六）
• 再小心移除C,、D兩孔的塞子,。把E、F兩孔塞緊,，同樣的操作從C加入65μl培養(yǎng)基,。
• 用20μl槍頭從C中加入15μl作為趨化因子的細胞懸液，用同一個槍頭從D中吸出15μl,。
• 重復上步操作,，加入總量30μl的細胞懸液。
• 將所有孔塞緊,，靜置30分鐘后,，就可以進行圖像采集。

圖六：加入作為趨化因子的細胞,。需先用無細胞的培養(yǎng)基將儲液池充滿,，再逐漸加入細胞，加入后將所有塞子塞緊靜置一會,，再開始實驗,。

●對照,，在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學趨化物培養(yǎng)基作為空白對照（-/-），和兩個儲液池均加入30μl細胞懸液作為陽性對照（+/+）,。
●按說明,，將通道加液孔塞緊后可以進行圖像采集。
●將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中,，調(diào)整好采集位點,，開始錄制實驗結果。

三,、圖像處理
1.手動細胞軌跡追蹤
●下載ImageJ,，并安裝Manual Tracking模塊
●導入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”,，選擇“Add track”開始記錄細胞軌跡
●選擇一個細胞，按照時間點單擊細胞,，*點擊后,，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點擊,，都將在這個新窗口中產(chǎn)生一個該細胞隨著時間的新坐標
●統(tǒng)計完足夠的細胞軌跡后,，保存軌跡坐標表格
●至少收集30個細胞的軌跡才具有統(tǒng)計學意義，避免同一細胞追蹤兩次,，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細胞
●可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導出

2）全自動細胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動分析平臺,，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個工作日后,，會得到細胞軌跡的坐標表格數(shù)據(jù)結果,。

四、數(shù)據(jù)處理

使用遷移指數(shù)（ Forward Migration Indices*,，F(xiàn)MIs）作為比較趨化實驗和對照試驗的參數(shù),。在有趨化物的情況下，空白對照的FMI和與趨化物垂直方向的化學趨化的遷移指數(shù)（FMI┴）應是在0點左右,。而與趨化物平行方向的化學趨化的遷移指數(shù)（FMI‖）與0點有顯著的區(qū)別表現(xiàn)出了化學趨向性,。同時，使用Rayleigh Test**對細胞趨化的方向性進行檢驗,。如果p值大于0.05表示了細胞運動的無序性,，表明沒有方向性的遷移。此外,，遷移速率等參數(shù)也能直接用于分析,。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)