本應(yīng)用說明是在µ-Slide ibiPore SiN載玻片內(nèi)創(chuàng)建單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的方案,。在涂層和細(xì)胞接種后,，使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)將內(nèi)皮單層暴露于單向?qū)恿骷羟袘?yīng)力下,。該方案的重點是將µ-Slide ibiPore SiN與使用ibidi pump system泵系統(tǒng)施加剪切應(yīng)力相結(jié)合,。

　　ibidi用于研究動態(tài)或靜態(tài)條件下遷移和傳輸?shù)慕鉀Q方案：

　　• µ-Slide ibiPore SiN

　　• ibidi Pump System

　　相關(guān)文件：

　　•Instructions µ-Slide ibiPore SiN

　　•Instructions ibidi Pump System

　　1,、材料

　　•µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (貨號：85216-S,ibidi,德國)

　　•ibidi Pump System泵系統(tǒng) (貨號：10902.ibidi,德國)

　　•灌流管套裝紅色,，15cm,內(nèi)徑1.6mm (貨號：10962.ibidi,德國)

　　•螺旋式管道夾 (貨號：10861.ibidi,德國)

　　•人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，HUVEC,(貨號：C-12203.PromoCell,德國)

　　•內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(貨號：C-22010.PromoCell,德國),輔以內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基補充混合液(貨號：C-39215.PromoCell,德國)

　　•Accutase細(xì)胞解離液(貨號：A1110501.Gibco)

　　•IV型膠原蛋白(貨號：354233.Corning)

　　•標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(無菌工作臺,、細(xì)胞培養(yǎng)箱,、培養(yǎng)瓶、PBS等)

　　重要提示：在實驗前一天,，將所有所需材料(如 µ-Slides 載玻片,、培養(yǎng)基和灌流管(套裝)在37°C和5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過夜,，這對防止氣泡隨時間產(chǎn)生至關(guān)重要,。

　　2、包被載玻片

　　•按照生產(chǎn)商的說明,，將IV型膠原蛋白涂層溶液稀釋至40µg/mL的最終濃度

　　•在 µ-Slide 載玻片上涂上一層涂層 (詳細(xì)的涂層方案見 µ-Slide ibiPore SiN 使用說明)

　　•吸干涂層溶液

　　•用PBS沖洗兩次

　　•在室溫下晾干 µ-Slide 載玻片,，然后再接種細(xì)胞

　　3、制備及接種細(xì)胞

　　•在添加了混合補充劑的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC

　　•用 Accutase 細(xì)胞解離液處理細(xì)胞2分鐘,，使其分離

　　•收集細(xì)胞懸液

　　•離心細(xì)胞懸浮液,，用生長培養(yǎng)基稀釋以獲得所需的濃度

　　•計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整至2x106 cells/ml的濃度,，使細(xì)胞貼壁后的光學(xué)匯合度達(dá)到100%

　　• 將細(xì)胞接種到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(細(xì)胞播種的詳細(xì)說明請參閱μ-Slide ibiPore SiN使用說明),。

　　•在37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)兩小時，讓細(xì)胞貼壁,。

　　重要提示：用于繁殖的培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞不應(yīng)生長到接近100%的光融合,。融合的單層進(jìn)入生長抑制狀態(tài)，這會阻止細(xì)胞增殖并改變細(xì)胞的生理機能,。只有在需要單層培養(yǎng)的實驗中,，才建議采用100%匯合。

　　4,、灌注

　　•在相差顯微鏡下控制細(xì)胞貼壁的程度

　　•為清除 ibidi Pump System 泵系統(tǒng)中的氣泡,，在連接 μ-Slide ibiPore SiN載玻片前，先讓其運行1-2小時

　　重要提示：實驗當(dāng)天如何清除系統(tǒng)中的氣泡,，請參閱ibidi Pump System泵系統(tǒng)使用說明

　　•用 ibidi 螺旋式管道夾或霍夫曼管道夾夾住灌流管的管道

　　•將 µ-Slide ibiPore SiN載玻片連接到管道上

　　•緩慢打開夾緊的管道,，以盡量減小壓力峰值

　　•按照下表中的參數(shù)開始灌注實驗。開始時低流量是使細(xì)胞適應(yīng)剪切應(yīng)力的必要條件

　　5,、結(jié)果

　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 載玻片中以 10dyne/cm2流體剪切力條件下培養(yǎng)(A)和靜態(tài)條件下(B)培養(yǎng)24小時,，窗口大小2mm×2mm，4倍物鏡,，相差,，比例尺200µm