細胞內(nèi)的鈣稱為細胞內(nèi)鈣,，可受到高度調(diào)節(jié),；這種緊密的調(diào)節(jié)使細胞內(nèi)鈣成為了解細胞功能和信號動力學的較佳的工具，使其能夠在細胞遷移,、交流和對刺激物或異物作出反應的能力,。

　　鈣：細胞過程的多功能指示劑

　　鈣信號可作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應的能力，并剖析所涉及的信號通路,。有幾種細胞內(nèi)鈣的熒光指示劑是可用于研究細胞功能,；能夠檢查傷口愈合、傳染病,、藥物治療等過程中的細胞反應,。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細胞的活細胞成像，其中熒光的增加表明細胞內(nèi)鈣的增加,。

　　鈣指示劑的種類及其應用

　　鈣指示劑主要分為兩大類：化學指示劑和基因編碼的鈣指示劑,。可用于活細胞成像實驗的鈣指示劑類型取決于預期的細胞系,、成像長度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預期結(jié)果等因素,。

　　1.預期細胞系：

　　對于原代細胞系直接的方法是使用熒光染料，將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養(yǎng)的細胞中,，并在孵育期后成像,。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮,、更穩(wěn)定,。在活細胞成像中，熒光染料可以有效地進行短期活細胞成像,，但隨著時間的推移細胞有排出染料的趨勢,。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映,，類似于在天然組織中的表達,。

　　在廣泛的鈣信號傳導實驗中,，已建立的細胞系是可以被轉(zhuǎn)導以表達遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP,、黃色cameleon等,。對現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進行改進，使指示劑更亮,，光穩(wěn)定性更好,，動態(tài)范圍更大，從而提高了鈣的敏感性,。慢病毒轉(zhuǎn)導是細胞系中使用的一種較佳的工具,，它將允許您選擇的指示劑在細胞系中穩(wěn)定表達?；蚓幋a報告系統(tǒng)的一個潛在問題是,，并非所有細胞系都容易被轉(zhuǎn)導?！　?/span>

　　在用ADP 進行激動劑治療期間,，人腸道類器官單層的實時、短期成像,。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s,。ADP 是一種已知的激動劑，用于在細胞中引發(fā)細胞內(nèi)鈣信號傳導,。激動劑治療是測試治療劑量反應的較的好方法,。

　　2.成像長度

　　對于活細胞成像，時間長度和間隔是需要記住的重要參數(shù),。細胞成像過程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性,。應避免持續(xù)使用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強的曝光時間和光功率,，以檢測鈣信號,，但不要過強，以免對細胞造成損害,。成像的長度將取決于實驗,。對于測試激動劑或細胞反應，這通常是5-20分鐘的較短成像運行,，每1-2秒捕獲一次圖像,。對于研究傷口修復或病毒感染期間鈣信號傳導的實驗，我們會在18-20小時內(nèi)成像,，每分鐘捕捉一次圖像,。　　

　　活細胞成像的技巧

　　考慮要使用的細胞系是很重要的,。為了研究鈣動力學,，使用形成單層的細胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦,，以捕捉信號動力學，從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化,。對于涉及細胞間通訊和鈣動力學的實驗,，細胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像,，選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學級塑料載玻片,，因此最好測試腔室載玻片,。我們的細胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片?！　?/span>

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　　活細胞成像是使細胞的密度允許形成一個融合的單層,，但不會導致細胞過度擁擠和團塊。在成像過程中需要使用合適的培養(yǎng)基,。許多傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)基含有酚紅,，它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實信號,。因此,，重要的是用PBS洗滌細胞，并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基,?！　?/span>