ibidi3孔可移除腔室載玻片可對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、固定和染色,，為其免疫熒光實(shí)驗(yàn)提供一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的方案,。

　　實(shí)驗(yàn)使用材料：　　

　　此次實(shí)驗(yàn)所需使用的材料和試劑如下所示,。此外，還需要配備一臺(tái)有適當(dāng)濾光片組的倒置或正置熒光顯微鏡,?！　?/p>

　　·3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）　　

　　·3孔可移除培養(yǎng)專(zhuān)用圓形15mm蓋玻片及配套工具,，（ibidi,，10815）　

　　·細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）　　

　　·細(xì)胞培養(yǎng)基　　

　　·細(xì)胞培養(yǎng)試劑　

　　·PBS　　

　　·福爾馬林中性緩沖液,，10％（Sigma,，HT5011）　

　　·染色試劑：DAPI（Sigma，D954）,、DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics,，490-33）　

　　·封片劑：FluoroshieldTM（Sigma，F(xiàn)6182）

　　實(shí)驗(yàn)操作解決方案：細(xì)胞培養(yǎng),，固定,，染色和成像觀(guān)察--都是在一個(gè)開(kāi)放型小室中搞定：　　

　　第1步：必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類(lèi)型,，用2-6x104細(xì)胞/ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層,。　　

　　1. 在無(wú)菌條件下,，打開(kāi)3孔可移除腔室載玻片（ibidi,，80381）包裝?！　?/p>

　　2. 像往常一樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化和計(jì)數(shù),。MCF-7細(xì)胞濃度為3×104細(xì)胞/ml ?！　?/p>

　　3. 將1100μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中,。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻,。為獲得更均勻的細(xì)胞分布,，請(qǐng)使用3孔可移除培養(yǎng)專(zhuān)用圓形15mm蓋玻片?！　?/p>

　　4. 用配套的蓋子蓋住,。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)?！　?/p>

　　5. 細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí),，或直到建立融合的單層?！　?/p>

　　第2步：固定是染色程序的第一步,。目的是將細(xì)胞,、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織維持在當(dāng)前狀態(tài)，并通過(guò)化學(xué)試劑在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存制劑,?！　?/p>

　　1.小心地抽吸細(xì)胞培養(yǎng)基?！　?/p>

　　2.用PBS洗兩次,。　　

　　3.加入1100μl福爾馬林溶液,。　　

　　4.室溫下孵育30分鐘,?！　?/p>

　　5.小心地抽吸福爾馬林溶液?！　?/p>

　　6.用PBS洗滌三次　　

　　第3步：應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑,。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架?！　?/p>

　　1.準(zhǔn)備你的染色溶液：PBS,、DYE-490鬼筆環(huán)肽（每單元/玻片，50 μl/單元）,、DAPI 1μg/ml　　

　　2.小心吸出PBS,。　　

　　3.用蓋玻片拾取工具抓取15毫米的圓形蓋玻片,，并將其放置在腔室孔內(nèi)的圓形邊緣上,。　　

　　4.將移液管-尖-端-插入其中一個(gè)角槽中,，將150μl染色液移入孔中,。　　

　　5.在室溫下避光孵育30分鐘　　

　　第4步：染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號(hào)　　

　　1.通過(guò)在一個(gè)角槽中添加950μl緩沖液來(lái)移除蓋玻片,?！　?/p>

　　2.用Coverslip Pick-Up Tool蓋玻片拾取工具或鑷子抓取漂浮的蓋玻片，將其從孔中取出,?！　?/p>

　　3.如有必要，重復(fù)洗滌步驟,，抽吸緩沖液并在每孔中移液1100μl緩沖液,。圓形的15毫米蓋玻片無(wú)需額外的洗滌步驟?！?/p>

　　第5步：從一個(gè)邊緣開(kāi)始,，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈,。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行,，以避免損壞細(xì)胞層,。

　　第6步：完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品,。該步驟還可防止樣品脫水,。　　

　　1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲,，去除樣品中多余的介質(zhì),。　　

　　2.將封固劑涂在樣品上,。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品,，小心地將蓋玻片放到封片劑上，以避免夾住任何氣泡,?！　?/p>

　　Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific),?！　?/p>

　　3.等封片劑固定好。

　　第7步：顯微觀(guān)察　　

　　使用可移除3孔腔室載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞,。用DAPI和染料490對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色,。圓形15mm蓋玻片減少了所需的染色溶液的量。用硬化封片劑安裝載玻片,，可使樣品長(zhǎng)期保存,。　　

　　圖1 MCF-7細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架用DYE 490鬼筆肽染色（左上）,，細(xì)胞核用DAPI染色（右上）,。下圖顯示了合成圖像，細(xì)胞核為藍(lán)色,，肌動(dòng)蛋白骨架為綠色,。（比例尺：100μm）

　　訂購(gòu)信息：