Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室載玻片為實驗培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞提供了一種簡單且高效的實驗方案~

　　實驗方案：

　　細(xì)胞培養(yǎng)，固定,，染色和成像觀察--都是在一個開放型小室中搞定：

　　實驗步驟1：

　　必須在預(yù)實驗中確定細(xì)胞系的正確接種濃度,。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用4-6x104細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層,。

　　1.在無菌條件下，打開8孔可移除腔室載玻片（ibidi,，80841）包裝,。

　　2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×104細(xì)胞/ ml MCF-7,。

　　3. 將400微升細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個孔中,。避免搖晃，因為這會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻,。

　　4. 用配套的蓋子蓋住,。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時,，或直到建立融合的單層,。

　　實驗步驟2：

　　固定是染色程序的第一步。目標(biāo)是將細(xì)胞,，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài),，并在較長時間內(nèi)通過化學(xué)試劑保存。

　　1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基,。

　　2.用PBS洗兩次,。

　　3.加入400μl福爾馬林溶液。

　　4.在室溫下孵育30分鐘。

　　5.小心吸入福爾馬林溶液,。

　　6.用PBS洗滌三次,。

　　實驗步驟3：

　　應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動蛋白骨架,。

　　1.準(zhǔn)備你的染色溶液：PBS,、DYE-490鬼筆環(huán)肽、DAPI 1μg/ml

　　2.小心吸出PBS,。

　　3.移取400μl染色溶液到每個孔中

　　4.在室溫下避光孵育30分鐘

　　實驗步驟4：

　　染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號

　　1.小心地吸出染色溶液

　　2.加入400μl緩沖液

　　3.小心地吸出緩沖液

　　4.重復(fù)步驟2和步驟3至少一次

　　實驗步驟5：

　　從一個邊緣開始,，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢,，穩(wěn)定的進(jìn)行,，以避免損壞細(xì)胞層?！　?/span>

　　實驗步驟6：

　　完成染色程序后,，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水,。

　　1.將載玻片側(cè)面在干凈的實驗室濕巾上輕敲,，去除樣品中多余的介質(zhì)。

　　2.將封固劑涂在樣品上,。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品,，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡,。Tip：建議使用硬化封片劑,，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

　　3.等封片劑固定好,?！　?/span>

　　實驗步驟7：顯微觀察　　

　　在可移除8孔腔室載玻片中免疫染色的MCF-7細(xì)胞的熒光顯微鏡檢查。綠色：α-微管蛋白,，紅色：F-肌動蛋白（鬼筆環(huán)肽）,，藍(lán)色：細(xì)胞核 (DAPI)。使用20倍物鏡拍攝寬場熒光圖像,。

　　ibidi提供了一種簡單且經(jīng)濟(jì)高效的方案,，使用一片可移除的腔室載玻片可進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，固定和染色,，無需爬片,，是倒置/正置顯微鏡以及長期樣品儲存的理想選擇。

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