此次實(shí)驗(yàn)是以HUVEC細(xì)胞為例，來介紹腫瘤學(xué)血管生成實(shí)驗(yàn)的操作過程這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過程,。

圖一  血管生成鏡檢圖

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠　　

　　1）實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中,，放入4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化,。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）　　

　　2）開始實(shí)驗(yàn)前,，將Matrigel始終保持放在冰盒中?！　?/p>

　　3）打開滅菌包裝,，取出ibidi血管生成載玻片?！　?/p>

　　4）每孔中加入10μl Matrigel,。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠,。

　　由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng),，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10μl的膠,，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

　　如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：　　

　　我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿,。

　　如上圖所示,，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙,，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿,，格子被放大了,，那么膠就加多了,，格子沒發(fā)生什么變形,，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

　　2  凝膠　

　　1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子,?！　?/p>

　　2）準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾,，制成一個(gè)濕盒,。　　

　　3）將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,，蓋上培養(yǎng)皿蓋,。　　

　　4）將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,，靜置30分鐘左右,，等待膠凝結(jié)?！　?/p>

　　5）等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液,。

　　3  鋪細(xì)胞　

　　加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前,，要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞,，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可,。　　

　　1）準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,，充分混勻,。　　

　　2）將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出,?！　?/p>

　　3）每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方,，不要接觸下孔的凝膠,。可以使用排槍,?！　?/p>

　　4）同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基,，使上孔液體正好加滿,。　　

　　5）蓋上蓋,，靜置,，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面,。

　　4  采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果　　

　　可以按照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像,，并且對(duì)其成管長(zhǎng)度，覆蓋面積,，成環(huán)數(shù),，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,。

　　5  免疫熒光染色　　

　　根據(jù)需要,，可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色?！?/p>

　　1）小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基,，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)?！　?/p>

　　2）加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)?！?/p>

　　3）在室溫下避光孵育30分鐘,。　　

　　4）使用PBS清洗三次,，注意,，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞,?！　?/p>

　　5）使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像?！?/p>