此次實驗是以HUVEC細胞為例,，來介紹腫瘤學血管生成實驗的操作過程這一實驗的詳細過程,。

圖一  血管生成鏡檢圖

　　實驗步驟：

　　1、準備基質(zhì)膠　　

　　1）實驗前一天將Matrigel置于冰盒中,，放入4℃冰箱,，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4℃預冷的槍頭用于吸取Matrigel）　　

　　2）開始實驗前,，將Matrigel始終保持放在冰盒中,。　　

　　3）打開滅菌包裝,，取出ibidi血管生成載玻片,。　　

　　4）每孔中加入10μl Matrigel,。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

　　由于Matrigel流動性不強,，并且有可能移液槍不準確,，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,，必然會影響到實驗的成像結(jié)果,。

　　如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：　　

　　我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

　　如上圖所示,，垂直透過每個孔看下面的格子紙,，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿,，格子被放大了,，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形,，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài),。

　　2  凝膠　

　　1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子,。　　

　　2）準備一個10cm的培養(yǎng)皿,，放入浸過水的紙巾,，制成一個濕盒?！　?/p>

　　3）將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,，蓋上培養(yǎng)皿蓋?！　?/p>

　　4）將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié),?！　?/p>

　　5）等待同時準備細胞懸液。

　　3  鋪細胞　

　　加入細胞的量直接影響實驗結(jié)果,，所以在正式實驗開始之前,，要對不同類型的細胞和使用數(shù)量進行預實驗。獲得最佳比例的細胞密度,。我們今天的實驗使用HUVEC細胞,，每孔種10000個細胞即可?！　?/p>

　　1）準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液,，充分混勻?！　?/p>

　　2）將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出,。　　

　　3）每孔加入50μl的細胞懸液,，注意保持槍頭垂直在上孔的上方,，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。　　

　　4）同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,，如果沒有,，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿,?！　?/p>

　　5）蓋上蓋，靜置，一段時間后,，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面,。

　　4  采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果　　

　　可以按照細胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度,，覆蓋面積，成環(huán)數(shù),，結(jié)點數(shù)進行測量和記錄,，并且對其進行統(tǒng)計分析。

　　5  免疫熒光染色　　

　　根據(jù)需要,，可以對成管結(jié)果進行免疫熒光染色,。　

　　1）小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基,，注意不要碰到膠或者細胞網(wǎng)絡,。　　

　　2）加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160),。　

　　3）在室溫下避光孵育30分鐘,?！　?/p>

　　4）使用PBS清洗三次，注意,，PBS要緩緩加入上孔,，以免沖擊掉細胞?！　?/p>

　　5）使用 485 nm/ 529 nm進行免疫熒光成像,。