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應(yīng)用Ibidi傷口愈合插件進行共培養(yǎng)“傷口愈合"實驗,,對周細胞與肺微血管內(nèi)皮細胞做共培養(yǎng)遷移試驗。
實驗步驟:
1)鋪細胞(圖二)
將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護膠帶撕除,。在ibidi細胞插件的每孔中分別加入1.5 ×104的PMVECs和Pericyte的細胞懸液,。注意不要大力晃動培養(yǎng)皿。以防止細胞不均勻,。在37℃培養(yǎng)箱中孵育
圖二,,ibidi傷口愈合插件中加入細胞
2)形成“劃痕"
采用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞16小時。如圖四所示,,小心的用鑷子夾住插件的一個角,,將插件移除?! ?/p>
圖三,移除插件
移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕",?! ?/p>
小心的清洗細胞,之后加入2ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(圖四)
采集并分析圖像:
在顯微鏡下選取能同時看到“劃痕"和兩邊細胞的視野進行成像,,“劃痕"的方向最好是水平或者垂直,。
采集0h和6h的圖像,,觀測細胞的遷移率和細胞遷移方向,,用中性粒周蛋白定位微管生長中心(MTOC)并用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-actin
由圖可見,相對于左側(cè)的對照,,右邊的PAH來源的Pericytes遷移距離較短,,并且從熒光標(biāo)記圖上可見,紅色箭頭表示遷移的方向,,PAH組無特定方向,,不受PMVEC的影響。柱狀圖為統(tǒng)計結(jié)果,。
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