為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲特性,，建立了體外2D侵襲方案,。

　　2D侵襲方案是一種共培養(yǎng)試驗(yàn),，在這種情況下,，是由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）組成的,。一旦兩種細(xì)胞類型接觸,，在不同的條件下評(píng)估侵襲成纖維細(xì)胞單層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，在我們的研究中,，我們?cè)谀M實(shí)體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的條件,，例如與基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）的相互作用以及成纖維細(xì)胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）,。我們使用A375黑色素瘤細(xì)胞系和真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行了此測(cè)定,。黑色素瘤細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞，繼而維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),，惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性（Flach等,，2011）。然而,，在刺激所測(cè)試的抗癌化合物后,，我們發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞直接接觸的黑素瘤細(xì)胞顯示出運(yùn)動(dòng)能力受損并且未能侵襲成纖維細(xì)胞層。

　　ibidi腫瘤細(xì)胞2D侵襲檢測(cè)方案實(shí)驗(yàn)流程：　　

　　01. 將GFP-A375和番茄成纖維細(xì)胞系穩(wěn)定地保存在MEF培養(yǎng)基中,，在37°C和5%C02加濕培養(yǎng)箱中,。　　

　　02. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合度（約80％融合度）時(shí),，在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們,，以去除死細(xì)胞和碎片,?！　?/p>

　　03. 在培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細(xì)胞約5分鐘，然后添加MEF培養(yǎng)基以阻止反應(yīng),?！　?/p>

　　04. 將細(xì)胞懸浮液收集在15ml細(xì)胞培養(yǎng)管中，并用臺(tái)式離心機(jī)（1500xg,5′,RT）短暫離心,?！　?/p>

　　05. 將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中；將一體積的細(xì)胞懸液與另一體積的臺(tái)盼藍(lán)溶液混合,，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞,。　

　　06. 在MEF緩沖液中以4x105細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞,?！　?/p>

　　07. 在多孔板上，在每個(gè)孔的中間放置一個(gè)Culture-Insert2孔（2孔培養(yǎng)插件）,?！　?/p>

　　08. 用75µl（3x104細(xì)胞）FP-A375細(xì)胞填充插入物一側(cè)，并用番茄成纖維細(xì)胞填充另一側(cè),。用移液器上下混合插入物中的細(xì)胞,，以確保細(xì)胞*分布?！　?/p>

　　09. 將多孔板放在培養(yǎng)箱中，放置過夜,。　　

　　10. 第二天,，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養(yǎng)基和插件,，并用PBS清洗?！　?/p>

　　11. 小心除去PBS,，然后加入新鮮的MEF培養(yǎng)基,?！?/p>

　　12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細(xì)胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)?！　?/p>

　　13. 一旦每個(gè)孔中的間隙*閉合，請(qǐng)使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像,。確保腫瘤細(xì)胞尚未侵入成纖維細(xì)胞單層,。　

　　14. 小心地除去培養(yǎng)基,，并在控制組孔中添加培養(yǎng)基+0.1％PBS,，在處理組孔中添加培養(yǎng)基。將板放在培養(yǎng)箱中24小時(shí)（處理孵育時(shí)間）,?！　?/p>

　　24小時(shí)后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養(yǎng)孔,，以評(píng)估治療組與對(duì)照組（綠色熒光細(xì)胞散布在紅色標(biāo)記層上）的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的任何變化,。

　　將黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）,。24小時(shí)后,，評(píng)估侵襲成纖維細(xì)胞層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。A375細(xì)胞顯示出大規(guī)模的侵襲行為,，受到MithramycinA治療的損害,。比例尺：500μm,。