ibidi提供了一個簡單經濟高效的方案,，使用可移除的12孔腔室載玻片進行細胞的培養(yǎng),，固定和染色,。培養(yǎng)MCF-7細胞并用formalin溶液固定,。細胞核用DAPI和肌動蛋白骨架用DYE-490鬼筆環(huán)肽染色,?？梢允褂靡豢购投谷旧ㄟ^免疫細胞化學探測其他細胞內結構。

德國ibidi 81201載玻片

實驗使用的材料和試劑列于下面,。

• 12孔腔室載玻片,，可移除（ibidi，81201）

• 用于腔室的蓋玻片,，可移除,，24mm x 60 mm（ibidi，10811）

• 細胞：MCF-7（CLS,，300273）

• 細胞培養(yǎng)基

• 細胞培養(yǎng)試劑

• 聚苯硫醚

• formalin溶液中性緩沖液,，10％（Sigma，HT5011）

• 染色試劑

o  DAPI（Sigma,，D954）

o  DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics,，490-33）

• 安裝介質：FluoroshieldTm值（Sigma，F(xiàn)6182）

實驗方案：

步驟1：

必須在預實驗中確定細胞系的正確接種濃度,。根據您的細胞類型,，用2-6x10 4細胞/ ml在2-3天內產生匯合的單層。
1.打開12孔可移除腔室載玻片（ibidi,，81201）包裝,，在無菌條件下可拆除。
2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計數細胞,。細胞濃度為5×104細胞/ ml MCF-7,。
3. 將250μl細胞懸浮液加入腔室的每個孔中。避免搖晃,，因為這會導致細胞分布不均勻,。
4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養(yǎng),。細胞至少培養(yǎng)24小時,，或直到建立融合的單層

步驟2：

固定是染色程序的第一步。目標是將細胞,，細胞形成物或組織維持在其當前狀態(tài),，并在較長時間內通過化學試劑保存。
1.小心地吸出細胞培養(yǎng)基,。
2.用PBS洗兩次,。
3.加入250μl的formalin溶液。
4.在室溫下孵育30分鐘。
5.小心吸入formalin溶液,。
6.用PBS洗滌三次,。

步驟3：

應根據感興趣的細胞結構選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細胞的細胞核和肌動蛋白骨架,。
1.準備你的染色溶液：· 聚苯硫醚· DYE-490鬼筆環(huán)肽· DAPI 1µg/ml
2.小心吸出PBS,。
3.移取250μl染色溶液到每個孔中
4.在室溫下避光孵育30分鐘

步驟4：

在染色后清洗你的樣本會使背景信號降到很低   
1.小心地吸出染色溶液 
2.加入250μl緩沖液     
3.小心吸入緩沖液   
4.重復步驟2和步驟3一次

步驟5：

從一個邊部開始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈,。該步驟應以緩慢,，穩(wěn)定的進行，以避免損壞細胞層,。

步驟6：

完成染色程序后,，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還防止樣品脫水,。
1.將載玻片側面在干凈的實驗室濕巾上輕敲,，從樣品中去除多余的介質。
2.將封固劑涂在樣品上,。用24毫米x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝的樣品,，小心地將蓋玻片放到安裝介質上，以避免夾住任何氣泡,。推薦使用諸如FluoroshieldTm值（Sigma-Aldrich）,，Vectashield®（Vector Laboratories Inc.）或ProLongAntifade®（ThermoFisher Scientific）的硬化封固劑。
3.安裝封固劑固化,。

步驟7：顯微觀察

使用12孔可移除載玻片培養(yǎng)MCF-7細胞,，用DAPI和DYE 490鬼筆環(huán)肽染色細胞結構。使用硬化封固劑安裝載玻片保存樣品以便長期儲存,。
圖1用DYE490鬼筆環(huán)肽（左上）染色MCF-7細胞的肌動蛋白骨架,，并用DAPI（右上）染色細胞核,。下圖顯示了合成圖像,，其中細胞核為藍色，肌動蛋白骨骼為綠色,。（比例尺：100μm）