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1,、物質(zhì)的定性:不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,,因此可用熒光進(jìn)行物質(zhì)的鑒別,。與吸收光譜法相比,,熒光法具有更高的選擇性,。
2,、定量測(cè)定:利用在較低濃度下熒光強(qiáng)度與樣品濃度成正比這一關(guān)系可以定量分析樣品中熒光組分的含量,常用于測(cè)定氨基酸,、蛋白質(zhì),、核酸的含量。熒光定量測(cè)定的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,,例如維生素B2的測(cè)定*可達(dá)1毫微克/毫升,,這一優(yōu)點(diǎn)使測(cè)定時(shí)所需要樣品量大大減少。 這種定量測(cè)定方法還可應(yīng)用于酶催化的反應(yīng),,只要反應(yīng)前后有熒光強(qiáng)度的變化,,就可用來(lái)測(cè)定酶的含量及酶反應(yīng)的速率等。
3,、研究生物大分子的物理化學(xué)特性及其分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象:熒光的激發(fā)光譜,、發(fā)射光譜、量子產(chǎn)率和熒光壽命等參數(shù)不僅和分子內(nèi)熒光發(fā)色基團(tuán)的本身結(jié)構(gòu)有關(guān),,而且還強(qiáng)烈地依賴(lài)于發(fā)色團(tuán)周?chē)沫h(huán)境,,即對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感。利用此特點(diǎn)可通過(guò)測(cè)定上述有關(guān)熒光參數(shù)的變化來(lái)研究熒光發(fā)色團(tuán)所在部位的微環(huán)境的特征及其變化,。在此研究中,,除了利用生物大分子本身具有的熒光發(fā)色團(tuán)(如色氨酸、酪氨酸,、鳥(niǎo)苷酸等,,此類(lèi)熒光稱(chēng)為內(nèi)源熒光)以外,可將一些特殊的熒光染料分子共價(jià)地結(jié)合或吸附在生物大分子的某一部位,,通過(guò)測(cè)定該染料分子的熒光特性變化來(lái)研究生物大分子,,這種染料分子被稱(chēng)為“熒光探針”,它們發(fā)出的熒光一般稱(chēng)為外源熒光,。熒光探針的應(yīng)用,,大大地開(kāi)拓了熒光技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用范圍。
4,、利用熒光壽命,、量子產(chǎn)率等參數(shù)可以研究生物大分子中的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象:通過(guò)該現(xiàn)象的研究,可以獲得生物大分子內(nèi)部的許多信息,。
以往人們常用熒光偏振做指標(biāo)來(lái)研究生物大分子動(dòng)力學(xué),。人們趨于用熒光偏振隨時(shí)間的衰減來(lái)研究這些問(wèn)題。在這種方法中,,激發(fā)光不是一連續(xù)的面偏振光,,而是一偏振的光脈沖,因此測(cè)得的F∥和F是在兩個(gè)不同方向上偏振的熒光隨時(shí)間的衰減,,它既和熒光壽命τ有關(guān),,又與分子在溶液中的運(yùn)動(dòng)有關(guān),因此常表示為F∥(t)和F⊥(t),。由它們可得一相當(dāng)重要的物理量——各向異性參數(shù)A(t),。由A(t)可推測(cè)生物大分子的形狀、分子轉(zhuǎn)動(dòng)弛豫時(shí)間(即從一個(gè)定向的狀態(tài)到一個(gè)無(wú)定向狀態(tài)所要的時(shí)間),,進(jìn)而可以推知生物大分子的大小,、分子在溶液中的轉(zhuǎn)動(dòng)角度和時(shí)間之間的函數(shù)關(guān)系。由這些結(jié)果可以研究分子之間的相互作用,、分子間結(jié)合的緊密程度,、蛋白質(zhì)、核酸分子的解聚程度等等,。
另外,,熒光技術(shù)在免疫學(xué)中亦有廣泛的應(yīng)用。zui重要的就是熒光抗體法,。將某些熒光染料與血清抗體相結(jié)合,,這種標(biāo)記的抗體仍可專(zhuān)一地與相應(yīng)抗原發(fā)生結(jié)合,形成的復(fù)合體具有熒光特性,,從而可以確定抗原或抗體的存在及其含量,。
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