NobleRyder 支原體檢測(cè)試劑盒 即用型

本試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測(cè)支原體污染。這種染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高（55％～80％）,，所以可將其染色而被檢測(cè)到,。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA染色斑,，說明有支原體污染,。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm,；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后,，最大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm,。

操作步驟：

貼壁細(xì)胞：

1.被檢細(xì)胞接種于無菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,，接種密度為1-2×104。同時(shí),，接種正常無支原體感染的同種細(xì)胞,，作為陰性對(duì)照。

2.5天后,，先吸去培養(yǎng)液,，再加入1ml的固定液，靜置20min,，

3.吸去固定液,，晾干。

4.于每孔中,，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞）,，37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液,，加入2ml滅菌超純水洗滌三次,，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液,，并以蓋玻片覆蓋,。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā),，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn),。

懸浮細(xì)胞：

1.收集需檢測(cè)的細(xì)胞，1500rpm，5min,。

2.將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上,，再加1ml的固定液，靜置20min,。

3.吸去固定液,，晾干。

4.于每孔中,，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞）,，37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液,，用無菌水洗滌玻片3次,，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封固液,，并以蓋玻片覆蓋,。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā),，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn),。

結(jié)果判斷（參考）：

陰性：僅見細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。

陽性：除細(xì)胞外,，細(xì)胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒,。

注意事項(xiàng)：

1.Hoechst工作液對(duì)人體有害，請(qǐng)注意防護(hù),。

2.固定液有刺激性氣味,，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。

3.支原體檢測(cè)時(shí),，最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3代,，這樣容易避免假陰性結(jié)果。

4.本試劑盒用于6孔板檢測(cè)時(shí),，可以進(jìn)行50次檢測(cè)反應(yīng),。

5.檢測(cè)支原體污染，可以使用支原體高效Vero細(xì)胞,，這樣可以提高檢測(cè)靈敏度,，即將被檢測(cè)樣品接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

NobleRyder 支原體檢測(cè)試劑盒 即用型