辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記套裝 NobleRyder P1100

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辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記套裝

保存條件：HRP（辣根過氧化物酶）-20度保存,，透析袋2－8度處理,。其他常溫保存。

產(chǎn)品說明：本套裝是將HRP標(biāo)記的常用試劑集合為一體而成,。本操作流程為經(jīng)碘的高碘酸氧化法,。適合于蛋白等含有氨基物質(zhì)的標(biāo)記,。特別是抗體的標(biāo)記,。

如果待標(biāo)記物分子量太小（如小于15KD）,，可能會(huì)穿過透析袋而造成樣品損失,。

標(biāo)記原理：在低PH下使RP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛基可蛋白等分子的氨基相連,，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH４還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記物,。

操作方法：

一,，  標(biāo)記量的計(jì)算：HRP（辣根過氧化物酶）分子量為40KD左右。一般為HRP：待標(biāo)記物＝2：1到4：1之間,。比如抗體IgG分子量一般為150－160KD,。則10mg HRP可標(biāo)記抗體在10mg-20mg之間。

二,，  計(jì)算好各步反應(yīng)時(shí)間,。作好開始標(biāo)記的準(zhǔn)備工作，是從下午開始,。將HRP（辣根過氧化物酶）一共10mg加入1ml雙蒸水溶解,。溶解后可放－20度存放一個(gè)月。如果想作兩次標(biāo)記,，可適當(dāng)稱量5mg,。但并不推薦稱量更小的質(zhì)量。以免產(chǎn)生更大誤差,。而且透析袋一般也只夠兩次用量,。

三，  剪切合適長(zhǎng)度透析袋，用雙蒸水清洗三次備用,。透析袋分寬窄兩種,，適合于不同量樣品的透析，請(qǐng)自己安排,。稱取21.3mg NaIO４,，加入0.5ml雙蒸水溶解（現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度為0.2M）,，將100mM乙酸鈉（PH4.4）用雙蒸水稀釋100倍成1mM乙酸鈉（PH4.4）,。準(zhǔn)備待標(biāo)記物，如果待標(biāo)記物本身鹽含量很低并且緩沖力差,，如生理鹽水,，可等二天再準(zhǔn)備。如果不確定,，將0.2M PH9.5 CB稀釋20倍（請(qǐng)不要一次稀釋完,，留1－2ml左右備用），作為透析液,，將待標(biāo)記物裝入透析袋中4℃透析過液，透析袋適當(dāng)留長(zhǎng)約2ml體積的量以備第二天加入酶（透析袋使用請(qǐng)見附錄）,。

四,，  以一次標(biāo)記完為例，如果標(biāo)記量小,，可按比例減小試劑的用量,。取0.2ml現(xiàn)配的NaIO４溶液加入HRP溶液中，混勻,，避光常溫反應(yīng)兩小時(shí),。裝入透析袋中，在稀釋過的乙酸鈉（PH4.4）溶液中4℃透析過液（透析袋使用請(qǐng)見附錄）,。

五,，  第二天早上，如果樣品為固體,，可用水溶解,，加入1/20體積的0.2M PH9.5 CB，混勻,。取出活化好的HRP裝入一適合離心管中,，加入50ul  0.2M PH9.5 CB，混勻,，立刻加入待標(biāo)記物中,，混勻。避光常溫反應(yīng)兩小時(shí)。

六,，  加0.1ml新配的10mg／ml NaBH４液,，混勻，常溫半小時(shí),。

七,，  配制合適的透析液，如生理鹽水或者PBS等,。透析酶標(biāo)記物,。

八，  如果有條件進(jìn)一步純化,，可透析半天后去進(jìn)一步純化,，如果不純化，請(qǐng)?jiān)?/span>4℃透析至少24小時(shí),。勤換液,。

附透析袋使用方法：

本透析袋已預(yù)處理過，用雙蒸水清洗后將水用適當(dāng)吸一下,。就可直接使用,。透析袋上下都可以用鐵夾，但如果鐵夾不夠用,，下部可用細(xì)線或者其他的透析袋夾,。

將透析袋輕輕的折上兩到三折。用線或者透析袋夾封住,，上面支開,，加入待透析物，留一定量的空氣在頂上,，并小心的折一折,，用鐵夾夾住，輕輕的擠壓,，如沒發(fā)現(xiàn)有液體流出,，可放入透析液中。一般透析可用純凈水瓶去頂使用,。用一次性筷子或者其他合適物穿過鐵夾,，將透析袋吊在透析液中，補(bǔ)充透析液,，使透析液蓋過透析袋中的液面而不要淹過鐵夾下面,。

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