Western blotting檢測試劑盒（ECL發(fā)光） NobleRyder P0960

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北京諾博萊德科技有限公司位于北京市海淀區(qū),，是一家專業(yè)從事生化試劑,、分子生物學(xué)試劑、實驗耗材及實驗儀器研發(fā),、銷售,、服務(wù)為一體的生物科技公司，公司主要經(jīng)營的進(jìn)口品牌包括Qiagen, Omega, Sigma, Invitrogen, Roche, Abcam, Santa cruz, Fermantas（MBI）, NEB, BD, Peprotech, Abnova, R&D systerms, GE, Biovision, Millipore, Amresco, Merck, CST, Axygen, Corning, NUNC, Thermo fihser, Eppendorf等,；產(chǎn)品涉及化工原料,、生化試劑、分子克隆相關(guān)試劑,、細(xì)胞培養(yǎng)及檢測常用試劑,、實驗室常用耗材及儀器。

Western blotting檢測試劑盒（ECL發(fā)光） NobleRyder P0960

Western blotting ECL發(fā)光法檢測試劑盒

試劑盒內(nèi)容：
1. 封閉試劑：30g（可配制400ml）脫脂奶粉及其他蛋白,，緩沖鹽等混合物,。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液，50ml,。
3. HRP標(biāo)記二抗,，0.1ml，效價1：2000-5000。
4. ECL顯色液,，25mlA+25mlB,。

試劑盒原理：
SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)按照分子量大小分離,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后,，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，加入發(fā)光底物后,，能讓膠片感光,。zui后經(jīng)顯影和定影后,，可以在膠片上顯示出條帶來（抗原所在位置）,。

操作步驟：
常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后，
1. 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后,，作好標(biāo)記,，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS,，防止影響后面的抗體結(jié)合,。
2. 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計，配制膜封閉液,，配好的膜封閉液為乳白色懸液,，將漂洗過的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi),，搖床震動,，室溫封閉30min。用TBS-T ,，PH7.6洗液,，室溫漂洗3次每次5min。
3. 將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml  10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水,，混勻,，可4℃保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液,。
4. 用1×的抗體稀釋液稀釋抗體,。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中,，加入一抗工作液,，封口，4℃孵育過液或37℃搖動孵育2h,。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次,。注：如果所加一抗不同,，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標(biāo)記,，分開孵育,。
5. 用TBS-T ，PH7.6洗液,，室溫漂洗3次每次5min,。
6. 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋二抗。根據(jù)用量,，按10ml抗體稀釋液加入5ulHRP標(biāo)記二抗的比例,，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中,，加入二抗工作液,，封口， 37℃搖動孵育1h,。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次,。
7. 用TBS-T ，PH7.6洗液,，室溫漂洗3次每次10min,。
8. 配制ECL發(fā)光液：根據(jù)用量，取ECL發(fā)光液A,、ECL發(fā)光液B各等量,，混勻，加在膜正面,，暗室顯色5分種,。先傾去顯色液，再小心用紙吸去顯色液,，在上面蓋一層平整的透明紙,。再取出感光膠片，做好標(biāo)記,，輕輕的放在膜上,，請小心不要錯動（余下的膠片請收好）。顯色30S到1分種,，取出（直接上抬）膠片立即*浸入顯影液中1-2min,，再丟入定影液中1分鐘，離開暗室,，觀察結(jié)果,，根據(jù)條帶強(qiáng)弱，可再次感光一次，并且減短或者加長感光時間（從5秒到30分鐘）以期達(dá)到理想結(jié)果,。

注意事項：
1. 請根據(jù)一抗來源選擇試劑盒,。而不是標(biāo)本來源來洗擇。因為二抗是與一抗反應(yīng)而不是與標(biāo)本反應(yīng),。
2. western blotting ECL發(fā)光法操作比較煩瑣,，但其敏感性較高，對于低豐度蛋白也能顯示出結(jié)果,。
3.可以根據(jù)顯色結(jié)果來優(yōu)化實驗反應(yīng)時間,。如背景過深，可延長膜封閉時間,，加長zui終漂洗次數(shù)與時間,。如果條帶過弱，可增加抗體濃度,，延長抗體孵育時間,，加長感光時間。
4. TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ,，Tris 1.21g ,，用800ml的雙蒸水溶解，用鹽酸調(diào)PH到7.6,，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至1000ml,，混勻即可,。（也可按照自己的配制習(xí)慣來配制）
如果實驗結(jié)果無條帶，可將稀釋過的一抗再作1倍,，10倍,，50倍稀釋，直接點到膜上（10ul）,，封閉,，加二抗，zui后顯色,，如果能顯出斑點來,，則證明顯色系統(tǒng)沒有問題，可從蛋白裂解和一抗上面找原因,；如果無法顯出,，請先從顯色系統(tǒng)尋找原因。