會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
點(diǎn)擊次數(shù)：661 發(fā)布時(shí)間：2017-7-24
1.概 述在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移,。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌,，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳,、分子遺傳,、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代,。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA 分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀,。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA 分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法,，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率*可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法為使用更廣泛,。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液,。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好,，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5 時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml 左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適,。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率,。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dna 應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA 的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低,。1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和,。一般情況下,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處,。
4. 防止雜菌和雜DNA 的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑,、DNA 酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA 的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩,。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH 菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS 質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化,。由于pBS 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子,。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS,，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS,。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后,，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳,、酶切等進(jìn)一步鑒定。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH 菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS 質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化,。由于pBS 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ),，可通過Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子,。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng),。能在Amp 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS,。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出,，進(jìn)行電泳,、酶切等進(jìn)一步鑒定。