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DNA芯片檢測siRNA專一性
點擊次數(shù)：728 發(fā)布時間：2017-7-18
長片斷的雙鏈RNA (dsRNA) 導(dǎo)入例如植物，真菌,，果蠅,，線蟲等生物的細(xì)胞中會引發(fā)同源mRNA的降解——這就是所謂的RNA interference (RNAi)。RNAi分兩個步驟,，首先是長片斷雙鏈dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25個堿基的small interfering RNAs (sirnas),。這些siRNA隨后和相關(guān)蛋白組合成為RNA-induced silencing complex (RISC) ，這個復(fù)合物以同源mRNA為靶摧毀mRNA,。兩年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳動物細(xì)胞中成功引發(fā)特異基因的沉默,，從此siRNA廣泛應(yīng)用于這個領(lǐng)域。
siRNA介導(dǎo)的基因沉默通常要求高度的序列專一,。Tuschl和同事證實siRNA和mRNA之間一個堿基的錯配都會導(dǎo)致基因沉默的失敗,，當(dāng)然這并不排除由siRNAs 引發(fā)的非特異基因沉默。siRNAs也有可能會引發(fā)一系列的部分同源的mRNAs沉默,，甚至有可能象超過30個堿基的長片斷dsRNA一樣通過引發(fā)抗病毒反應(yīng)—— 一種通常由于機體對抗病毒入侵產(chǎn)生的反應(yīng),，包括由蛋白激酶R和后繼的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻斷,，以及由 RNase L激活的非特異RNA降解。
這就意味著需要在全基因組范圍內(nèi)對siRNA的專一性進行檢測,。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法對siRNAs的專一性在全基因組范圍內(nèi)進行了檢查,。
Brown和同事檢查了兩個針對外源GFP基因的siRNAs的專一性，結(jié)論是關(guān)閉外源的GFP表達不會間接影響其他細(xì)胞內(nèi)源基因的表達水平,。2個GFP特異的siRNAs和兩個隨機無意序列對照siRNAs分別被轉(zhuǎn)染能瞬時或者持續(xù)表達GFP的人源293細(xì)胞,，結(jié)果通過GFP熒光水平檢測和FACS分析，GFP特異的siRNAs能夠沉默70%的GFP表達而對照則對GFP表達沒有影響,。從轉(zhuǎn)染和沒有轉(zhuǎn)染siRNAs的細(xì)胞中分離RNA,，標(biāo)記后和點有36000個人類基因的cDNA 芯片雜交。其中約有20000個基因在293細(xì)胞中表達,。結(jié)果表明這20000個基因中沒有一個的表達水平在轉(zhuǎn)染了特異或非特異siRNAs后發(fā)生顯著變化,。
對于RNAi 特異性的另一個關(guān)注焦點是：傳遞的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫"secondary siRNAs"的產(chǎn)生。Transitive RNAi是在線蟲的實驗中發(fā)現(xiàn)的,，也可能在其他生物中發(fā)生,。在這個過程中，siRNAs,，在變性后結(jié)合到互補的轉(zhuǎn)錄本上,，通過RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3"和5"端的延伸形成新的雙鏈dsRNAs,。這些dsRNAs被加工成為"secondary siRNAs",。這些二級siRNAs，如果和其他基因有同源,，可以導(dǎo)致其他基因表達的沉默,，這樣就強化了非特異基因沉默的可能性。
到目前為止,，在人類基因組中沒有發(fā)現(xiàn) RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP),，這提示在人類細(xì)胞中可能不會發(fā)生RNAi傳遞。然而這個假設(shè)并沒有被廣泛的驗證過,。Brown和同事也檢測了在人源細(xì)胞中是否存在傳遞RNAi現(xiàn)象,。他們將兩個報告基因(luciferase and GFP)分別和常見的actin序列融合，共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中,。他們檢測到一個報告基因的特異的siRNAs不能導(dǎo)致另一個報告基因沉默,。結(jié)果表明傳遞RNAi機制在人類中不存在。
研究結(jié)果支持已有的假設(shè)：siRNAs在高度序列專一的條件下發(fā)揮作用,，只能導(dǎo)致*互補的基因表達沉默,。人類細(xì)胞不存在傳遞RNAi現(xiàn)象的實驗結(jié)果同樣證實這種專一性,。
不過實驗受限于細(xì)胞類型和siRNAs類型,，特別是外源基因的siRNAs,。實驗結(jié)果仍然有待推廣到其他細(xì)胞類型，特別是內(nèi)源基因的siRNAs,，如果siRNAs在將來要應(yīng)用于基因治療,，這樣的實驗將尤為重要。