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Southern 雜交一般操作
點(diǎn)擊次數(shù)：911 發(fā)布時(shí)間：2017-6-22
一 基因組酶切和電泳
在200 μl 微量離心管中加入：
25 μl DNA樣品(約10μg),，
3μl 限制性內(nèi)切酶（MBI，10 U/ μl）
5 μl 相應(yīng)的10×buffer,，
補(bǔ)水到50μl,。
然后加一滴礦物油覆蓋, 稍微離心后放于37℃水浴8-12小時(shí)。酶切完后,，取5μl 酶切DNA樣品于0.8%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)酶是否充分,。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose膠,，加入上樣buffer后,，在25—30V穩(wěn)壓電泳12—16hrs。
注意：在southern雜交中對(duì),，DNA的質(zhì)量要求較高,，否則酶切不*導(dǎo)致失敗,。
二 轉(zhuǎn)膜
1 用0.2MHCl 脫嘌呤處理，偶爾輕輕振蕩至溴酚藍(lán)*變成黃色,，大約需要15~30分鐘,。然后用水漂洗凝膠2~3次，將水倒盡,，加入堿變性液,，偶爾輕輕振蕩至溴酚藍(lán)*恢復(fù)到原來的藍(lán)色（大約需要20~30分鐘）。
注意：此方法對(duì)酶切后目標(biāo)片段大于15kb時(shí)用,，如果小于15kb不要進(jìn)行脫嘌呤處理,，否則容易將片段打斷，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜后結(jié)合不緊密,。
2 取一磁盤架上一洗凈玻璃板,，在磁盤中倒入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在玻璃板上架兩層長(zhǎng)濾紙（30cm左右）（注意不要產(chǎn)生氣泡）搭成鹽橋,。（濾紙比膠弱寬）依膠大小裁好尼龍膜,，寫好標(biāo)記，正面向下,，緊貼于膠上,，防止有氣泡產(chǎn)生，接這壓兩張同樣大小的濾紙,，不可過大以免短路,，膠周圍用X光片壓條。膠應(yīng)反面朝上因?yàn)镈NA多在膠的底層,。堆積吸水紙,。上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物,。
注意：防止短路
3 轉(zhuǎn)膜16---20hrs后,，將尼龍膜取下，膠染色,，觀察轉(zhuǎn)膜效果,。將膜用2xSSC浸泡20分鐘，濾紙吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）,。待用,。
三 雜交
¨ 雜交爐與雜交管預(yù)熱至65℃
¨ 尼龍膜用2×SSC浸泡
配置雜交液
ssDNA沸水變性10min，冰浴10min,，置冰浴備用
Components Volume (ml) Note
ddH2O 20.7
50×Denhardts 0.6
P/H stock 8.1
20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)
Total 30 ml for 2 blots. 65℃預(yù)熱.
Add prepared ssDNA （10mg/L） ≥0.3 ml
倒入雜交液,，加入尼龍膜，65℃預(yù)雜交4~5小時(shí)（新膜）
注意：趕盡膜與膜之間的氣泡后把幾張膜同時(shí)放入雜交管，并用玻棒趕盡膜與管壁之間的氣泡,，zui后加入雜交液,，蓋好管蓋。
四 探針標(biāo)記
（for1~2 blots）
ddH2O 7 ml
Marker 1.5 ml
模板DNA 2 ml (about 100 ng)
沸水變性8min,，冰浴10min,，瞬時(shí)離心
Add Buffer+Primer 7.5 ml
Add dNTPs(-dCTP) 3 ml
Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)
瞬時(shí)離心
Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)
37℃ 水浴≥4小時(shí)
五 雜交
向標(biāo)記探針的離心管中
Add 等體積TE 25 ml
Add 10×體積變性劑（雜交液） 250 ml
沸水變性10min，冰浴10min,，將變性好的探針加入到雜交液中,，混勻，65℃雜交過夜（12~16小時(shí)）,。
六 洗膜
1. 2×SSC,0.5%SDS 5min
2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)
3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)
(洗膜過程中不斷檢測(cè)放射性強(qiáng)度直至200~500)
濾紙吸干洗液,，保鮮膜包好，暗室中壓片,，根據(jù)放射性強(qiáng)度暴光若干天,。
沖洗X光片。
說明：
由于做southern的整個(gè)過程比較復(fù)雜涉及到的試劑也比較多,，我這里僅做了個(gè)簡(jiǎn)要的敘述,，但基本的實(shí)驗(yàn)過程已列舉出來了，此過程中的試劑可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)調(diào)整,，如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具體的介紹,，請(qǐng)與我，我們共同討論學(xué)習(xí),，另外，做雜交的過程中一定要注意防止同位素泄漏,，做好個(gè)人的防護(hù)工作,。