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1. 早期檢測(cè)：

1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè)：PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生,，可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV,，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)(懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用),，可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。

2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：

這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對(duì)較新的趨勢(shì),，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生,。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過(guò)熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測(cè)凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來(lái)檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,，谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑,。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原,。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要,，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中,，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng),。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境,，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低,，從而使細(xì)胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),。

由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān),，此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病,、中風(fēng)等疾病治療的研究,。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測(cè),。

3)細(xì)胞色素C的定位檢測(cè) 細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì),，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下,，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中,，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9,，后者再激活caspase-3和其它下游caspase,。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí),，它保留在線粒體內(nèi),，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心,，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分,，再進(jìn)一步通過(guò)western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生,。

4) 線粒體膜電位變化的檢測(cè)：

在凋亡研究的早期,，從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入,，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分,，發(fā)生很多生理生化變化。例如,，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化,，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑,，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色,。正常細(xì)胞中,，它在線粒體中形成聚集體,，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中,，因線粒體穿膜電位的改變,，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光,。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào),。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。但是,，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化,。

2. 晚期檢測(cè)

細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA,，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA片段。對(duì)于這一現(xiàn)象的檢測(cè)通常有以下兩種方法：

1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP (多為dUTP)間接(通過(guò)地高辛)或直接接到DNA段的3’-OH端,，再通過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果,。美國(guó)Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記,，地高辛介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過(guò)氧化物酶聯(lián)顯色,，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織,、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測(cè),。其中，直接標(biāo)記步驟少,，操作簡(jiǎn)便,。而間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測(cè)靈敏度高,。

2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè))

當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很少(如活體組織切片)時(shí),，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過(guò)LM-PCR(ligation-mediated PCR),，連上特異性接頭,，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段,。此外,，LM-PCR 檢測(cè)是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較,。 上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征,，但細(xì)胞受到其它損傷(如機(jī)械損傷，紫外線等)也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象,，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾,。

3) emerase Detection (端粒酶檢測(cè))

這是相對(duì)來(lái)說(shuō)推出較早,，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白,，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列,，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒(méi)有端粒酶活性的,，每分裂一次,，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘,，表明細(xì)胞年齡,、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn),，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性,。Invitrogen公司的TRAP-eze emerase Detection Kit在1996年推出。它提供特定的寡核苷酸底物,，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對(duì)的引物,。如果待測(cè)樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基(GGTTAG)端粒重復(fù)序列,，通過(guò)PCR反應(yīng),，產(chǎn)物電泳檢測(cè)就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNA Ladder現(xiàn)象(參見(jiàn)圖4)。此外,，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)的試劑盒. 同樣,，這種檢測(cè)方法也不專對(duì)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,。

3.mRNA水平的檢測(cè)

研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因,，檢測(cè)這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道,，Fas 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cells)等靶細(xì)胞,。Bcl-2 和bcl-X (長(zhǎng)的) 作為抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活,。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè),。隨著近年來(lái)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確,。Invitrogen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術(shù)原理,，通過(guò)檢測(cè)fas,bax-alpha 和 bcl-X (長(zhǎng)的) 基因的 mRNA表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

4.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征,，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法,。

1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

1. 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形,，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體,。 貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓,、脫落,。

2. 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等,。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮,、邊緣化，核膜裂解,、染色質(zhì)分割

成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài),。

2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342),，HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI,。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū),。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光,。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性,，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色,。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml,。

結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊,，產(chǎn)生凋亡小體,。

3.透射電子顯微鏡觀察 結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮,。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞,，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitations)的空泡結(jié)構(gòu);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細(xì)胞凋亡的晚期,，細(xì)胞核裂解為碎塊,，產(chǎn)生凋亡小體。