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細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：571 發(fā)布時(shí)間：2017-4-10
一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?nbsp;
1、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征
2,、學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測(cè)正?；罴?xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法
二,、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì),、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界,，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用,。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合,，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程,。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。
在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸,，細(xì)胞變園,，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體,，凋亡小體zui后被吞噬細(xì)胞吞噬消化,。在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外，不會(huì)影響其它細(xì)胞,，因而不引起炎癥反應(yīng),。
在生物化學(xué)上,，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化,，活性增加,。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷,。如果對(duì)核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳,，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。
相比之下,，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡,。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細(xì)胞器膨脹,，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物,，引起炎癥反應(yīng)，壞死過程中細(xì)胞核DNA雖也降解,，但由于存在各種長(zhǎng)度不等的DNA片斷,，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀,。
一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)，也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死,，這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度,。
三尖杉酯堿（HT）是我國(guó)自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物,。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí),，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征,。本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,，同時(shí)，也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死,。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide,，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡,、壞死及正常細(xì)胞,。
細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜,。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí),，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,，它可嵌入到DNA或RNA中,，使壞死細(xì)胞著色,，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì),，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞,，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,，它是雙苯并咪唑的一種衍生物,。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞,。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞,。
三、實(shí)驗(yàn)用品：
1,、試劑：三尖杉酯堿（HT）,，300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5）,，5mol/L EDTA緩沖液,、堿性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）,；異丙醇,；70%乙醇；溴酚藍(lán),，蔗糖指示劑,。TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖,，溴乙錠,。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L,。
2,、儀器設(shè)備：熒光顯微鏡，電泳儀,，電泳槽,，微量加樣器（1ml,，100μl）0.5,、1.5ml離心管，載玻片,，蓋玻片,。
四、實(shí)驗(yàn)材料：
人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞,，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,，5%CO2條件下培養(yǎng),。
五、方法步驟：
1,、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡
（1）實(shí)驗(yàn)前約24小時(shí),，接種兩瓶HL-60細(xì)胞，標(biāo)記①,、②,，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。
（2）實(shí)驗(yàn)前約2.5小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%,，①號(hào)瓶加入三尖杉酯堿200μl,，使終濃度為1μg/ml，②號(hào)瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對(duì)照,。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時(shí),。
2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞
（1）染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻,，取200μl于1.5ml的離心管中,，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl,，染色15分鐘,。
（2）滴片：取一載玻片，用雙面膠圍成一小室,，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10μl,，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光,，高倍鏡下觀察,，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例,。
六,、注意事項(xiàng)：
1、誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確,。
2,、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅,，觀察時(shí)要盡量快,。