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體外培養(yǎng)細(xì)胞
點(diǎn)擊次數(shù)：725 發(fā)布時(shí)間：2017-4-5
一,、所謂細(xì)胞培養(yǎng)(Cell culture)是指細(xì)胞包括單個(gè)細(xì)胞在體外條件的生長(zhǎng),。
組織培養(yǎng)的發(fā)展史已有近百年，zui初的組織培養(yǎng)是胚胎學(xué)和微生物學(xué)的引申,，建立于無(wú)菌原則上,，用天然體液（如胎汁、血漿）來(lái)維持從整體切下的組織塊,，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)和功能的觀察,。
通過(guò)許多學(xué)者大的改進(jìn)和革新，培養(yǎng)基由天然動(dòng)物血漿改為合成培養(yǎng)基,，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)從胎汁改為動(dòng)物血清?，F(xiàn)在*貯存的細(xì)胞約有萬(wàn)種以上,。組織培養(yǎng)不僅是細(xì)胞生物學(xué)必需的技術(shù)，也是分子生物學(xué),、腫瘤學(xué),、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科必要的方法。
二．基本原理和方法
體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件：
(一)營(yíng)養(yǎng),。
體外培養(yǎng)細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)相同,，主要有糖、氨基酸和維生素三大類,。目前市面上銷售的合成培養(yǎng)基如1640,、199等所含的氨基酸已足夠，但在使用合成培養(yǎng)基時(shí),，仍需加入一些天然成份,，如人或動(dòng)物的血清,、血漿和胎汁等,。目前主要使用血清，以牛血清為主,。血清的生物效應(yīng)早已證明,，它含有多種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其它活性物質(zhì)等,。不僅能促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)且能幫助細(xì)胞貼壁,。不同血清對(duì)細(xì)胞作用不同。以小牛血清,，成年牛和馬血清次之,。合成培養(yǎng)基中不加血清也能維持細(xì)胞生存，但不能很好生長(zhǎng),，加入5%的血清,，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，能維持細(xì)胞不死和緩慢生長(zhǎng),，要使細(xì)胞正常生長(zhǎng),，一般需加10～15%的小牛血清。每個(gè)批號(hào)血清使用前要加熱處理,，一般滅活于56℃水浴中30分鐘,，每個(gè)批號(hào)血清使用前要加熱處理，一般滅活于56℃水浴中30分鐘,，每5分鐘搖一次,。10%血清營(yíng)養(yǎng)液能促進(jìn)細(xì)胞增殖稱為生長(zhǎng)液，2～5%血清培養(yǎng)液不能使細(xì)胞增殖而只能維持其生存稱為維持液,。添加血清,，雖利于細(xì)胞生長(zhǎng),，但增加了不明成分，給分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)了困難,。因此,，人們正在探索不用血清的無(wú)血清液并已取得了一定進(jìn)展。
（二）環(huán)境
1．無(wú)菌：無(wú)菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件,。培養(yǎng)液不僅對(duì)細(xì)胞是高營(yíng)養(yǎng)物,，對(duì)細(xì)菌和霉菌也是高度營(yíng)養(yǎng)物，細(xì)胞培養(yǎng)中如污染微生物,，其繁殖比細(xì)胞快且能產(chǎn)生毒素使細(xì)胞死亡,，因此細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵之一是防止污染。污染微生物可來(lái)源于組織培養(yǎng)液,、器皿,、組織本身、工作者本身,。因此,，培養(yǎng)室的空氣等要*消毒，所有操作均要嚴(yán)格實(shí)行無(wú)菌操作,，各種物品拿入操作臺(tái)前應(yīng)消毒,，用灑精擦表面，用前于紫外線照,；操作者洗手,、泡手，酒精擦手,，打開(kāi)培養(yǎng)管前須在火焰上烙燒一下瓶口以使灰塵固定,，操作時(shí)須將瓶、管斜放,，吸管注入液體應(yīng)避免和瓶口接觸,，操作時(shí)禁止講話。
2.溫度：組織培養(yǎng)的zui適溫度為35-37℃,，偏離這一溫度范圍,，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡,。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比高溫強(qiáng),。溫度增加2-3℃對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，使之在24小時(shí)死亡,，溫度在43℃以上,，細(xì)胞大多被殺滅，而低溫對(duì)細(xì)胞影響較小,，細(xì)胞置于25-35℃時(shí),，細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng),，但速度緩慢，放在4℃數(shù)小時(shí)之后,，再置37℃培養(yǎng),，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)。
3.氣體：氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一,。所需的氣體主要有O2和CO2,。O2參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種成分,。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物也是細(xì)胞所需成分,。它主要與維持培養(yǎng)液pH值有直接關(guān)系。
4.pH值：多數(shù)細(xì)胞的適宜pH值為7.0-7.4,，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞可產(chǎn)生有害的影響,。各種細(xì)胞對(duì)pH值的要求也不*相同，但總的來(lái)說(shuō),，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些,。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽/ CO2。細(xì)胞代謝產(chǎn)生的各種酸使pH下降,，而培養(yǎng)液中的NaHCO3產(chǎn)生CO2排入空間又使pH增加,。
5.培養(yǎng)器皿的處理：培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對(duì)于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)影響很大,，除少數(shù)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞外,，絕大多數(shù)細(xì)胞屬于貼壁依賴性細(xì)胞或培養(yǎng)物。它們只有貼附于不起化學(xué)作用的物體的表面時(shí),，才能生長(zhǎng),、生存或維持功能。目前,，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類,。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡1至7天，清水沖洗20次后再用蒸餾水過(guò)洗2次,，烤干備用,。用前160℃高溫消毒2小時(shí)后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小時(shí)后,，清水洗凈再用1N HCL浸泡4小時(shí),，用清水沖洗后再用蒸餾水漂洗，37℃干燥后,，紫外線燈照射消毒,；新橡皮塞須先用1/2NnaOH煮沸15分鐘，沖洗后再用4%HCL煮沸15分鐘,，清水沖洗后用蒸餾水洗5次,，煮沸10分鐘滅菌,，或送高壓滅菌。
總之,，細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可迅速增殖,，但若遇到不良環(huán)境細(xì)胞會(huì)變圓，停止生長(zhǎng),，甚至死亡,，這是細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。綜上所述,，細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件主要包括了營(yíng)養(yǎng)液,、無(wú)菌條件、PH,、溫度,、氣體條件和培養(yǎng)器皿的清潔度。
三．常用的培養(yǎng)方法
根據(jù)培養(yǎng)物細(xì)胞生物學(xué)的特點(diǎn),，組織培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),。亦可根據(jù)培養(yǎng)條件和器皿的不同而分為靜置培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)為zui常見(jiàn)的方式,，細(xì)胞可為貼壁型細(xì)胞,，亦可為懸浮的不貼壁細(xì)胞。