會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇
點(diǎn)擊次數(shù)：1127 發(fā)布時(shí)間：2017-3-20
冷凍保存與復(fù)蘇原理
在低于-70℃的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止,。因此,，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡,。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存,，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件）,，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程,。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過(guò)程,。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞,、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存,，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。
水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰,。如果將細(xì)胞懸浮在純水中,，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰,，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡,。
這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中,，隨著溫度的降低,，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高,。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏,，在復(fù)溫時(shí),，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡,。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱(chēng)為溶質(zhì)損傷或稱(chēng)溶液損傷,。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰,，產(chǎn)生冰晶損傷,。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷,。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合,，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成,，并且通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存,。在復(fù)蘇時(shí),，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫,，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶,，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能,。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率,、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣,。
¨冷凍速率
冷凍速率是指降溫的速度,，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃時(shí),，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn),，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5～-15℃之間時(shí),，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài),。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是,，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡,，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。冷凍速度不同,，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動(dòng)的情況也不相同：如果冷凍速度慢,，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水,，體積縮小,，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)發(fā)生結(jié)冰,；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有足夠的時(shí)間外滲,，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰,；如果冷凍速度非常快（即超快速冷凍）,，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）,。Luyet（1973）證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列,；另一種情況是非晶體即玻璃化,，液體中的分子呈無(wú)序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài),。
不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化,，也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)慢時(shí),，細(xì)胞脫水嚴(yán)重,，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過(guò)一定程度時(shí)即失去活性。同時(shí)冷凍速度過(guò)慢,，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰,，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷,。當(dāng)冷凍速度過(guò)快時(shí),，細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及外滲，會(huì)形成較到冰晶,，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞,，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對(duì)細(xì)胞存活來(lái)說(shuō)是zui為理想的冷凍方法,。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固,，無(wú)冰晶形成或形成很小的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷,，細(xì)胞也不會(huì)在高濃度的溶質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間暴露而受損,。
不同細(xì)胞的zui適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞,、酵母,、人紅細(xì)胞的zui適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min和200℃/min,。細(xì)胞與細(xì)胞之間的zui適冷凍速率可在1.6℃～300℃/min,，故對(duì)一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先需要測(cè)定其zui適冷凍速率,，以保證獲得zui高的冷凍存活率,。