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封閉劑的種類(lèi)及選擇
最近更新時(shí)間：2013-4-7
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封閉的原理：
固相載體表面（如ELISA板，NC膜或者PVDF膜上等）有很多洞洞,，通過(guò)電轉(zhuǎn)或包被,，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上,，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附的方式結(jié)合于表面,。
蛋白塞進(jìn)了表面的很多洞洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的,，有很多空隙,，而且比如說(shuō)樣品孔之間也有空隙，這些洞洞并沒(méi)有填進(jìn)東西,，而抗體也是蛋白,，也會(huì)被吸附在空的洞里,，這樣，就會(huì)有很多非特異性的信號(hào),。
封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結(jié)合,，同樣以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛?ldquo;填補(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合,，所以有“封閉”的說(shuō)法,。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。這樣,，抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上,，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合。
封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白,、不結(jié)合靶蛋白表位,、也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)，
封閉所用試劑：
1,、 BSA
BSA是zui常用的封閉劑,，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的,， BSA有很強(qiáng)的免疫原性,，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多的針對(duì)BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng),，不能用BSA,、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無(wú)蛋白的封閉劑封閉,。
大部分BSA中有少量的抗體殘留,，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng)，產(chǎn)生高背景,，雜帶較多或使得本底水平增高,。
2、 血清
封閉血清的原理主要有兩點(diǎn),，*是待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì),，從而導(dǎo)致背景過(guò)高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合,，從這點(diǎn)看,，BSA和血清沒(méi)有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體,，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合,，與抗體特異性無(wú)關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合,。BSA則無(wú)法封閉Fc受體,。
免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來(lái)源的,，血清中動(dòng)物自身的抗體,，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合,， 會(huì)造成背景,。但要注意封閉用血清中不能含有目標(biāo)蛋白，且與一抗來(lái)源不同,。另外二抗因盡量少選取兔子或老鼠來(lái)源的,，因?yàn)檫@兩個(gè)在親緣關(guān)系上和人類(lèi)非常接近，所以產(chǎn)生交叉反應(yīng)的機(jī)會(huì)就比較大,，從而導(dǎo)致背景比較高,。!適合選用來(lái)源于驢，山羊,，綿羊等的二抗,，背景相對(duì)就很低。
3,、 脫脂奶粉
脫脂奶粉zui大的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)錢(qián)便宜,，所以是，但是由于成分相對(duì)復(fù)雜,，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加,，此外,，因?yàn)樽陨砗猩锼?不能用于生物素標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。
奶粉蛋白種類(lèi)比BSA多,，而WB膜也好,，ELISA板也好，表面的微結(jié)構(gòu)都不是那么均勻的,，相對(duì)而言,，不同分子量蛋白種類(lèi)多的奶粉（BSA只是一種蛋白），封閉起來(lái)更全面,。
脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時(shí)，也會(huì)使得高背景或本底水平增高,。
由于奶粉的成份復(fù)雜,，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。
4,、 酪蛋白
和BSA作用類(lèi)似,，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負(fù)電性,，與同樣帶負(fù)電荷膠體金之間存在排斥力,，而膜一般都是帶正電荷，會(huì)與酪蛋白有一定的吸附作用,，用酪蛋白封閉效果好些,。
5、 無(wú)蛋白化合物
甲醛：與PVDF膜表面的微結(jié)構(gòu)反應(yīng)或者結(jié)合,，使之失去結(jié)合蛋白的疏水力或者空間結(jié)構(gòu)域,。
去污劑（吐溫-20）：有抗原修復(fù)的作用，與膜疏水性吸附,，有很強(qiáng)的對(duì)非特異性吸附的洗脫作用,，同樣可以降低蛋白間的疏水作用，可提高特異性抗體的識(shí)別能力,。
還有明膠,，PEG等也可作為封閉劑。