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質(zhì)粒DNA的小量制備
最近更新時間：2016-5-4
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準備工作：
細菌培養(yǎng)：挑取單菌落,，接種到3~5ml適宜的液體培養(yǎng)基(如氨芐青霉素抗性的標準lb培養(yǎng)基)中,，37℃震蕩培養(yǎng),。
注：（1）在細菌的對數(shù)生長晚期時提取,。過早則質(zhì)粒得率太低,，過晚則會有雜菌污染，或得到的質(zhì)粒雜質(zhì)太多,，影響其后的酶切,、電泳等處理；
（2）某些嚴緊型質(zhì)粒(如pBR322)需要在進入對數(shù)生長中期后,，在細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng),，以提高產(chǎn)量。
具體步驟：
1,、細菌的收獲：將1.5ml菌液倒入微量離心管中,，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液,。上清要務必吸取干凈,，否則會影響質(zhì)粒的質(zhì)量。必要時可以離心2次,。
2,、將細菌沉淀重懸于150μl用冰預冷的溶液Ｉ中，加入1/50體積RNAseA貯存液,，劇烈振蕩,，使之*分散。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖,，25mmol/LTris•Cl(pH8.0),，10mmol/LEDTA(pH8.0)
不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制,，煮沸15~30min,，-20℃分裝貯存
注：（1）溶液Ｉ高壓蒸氣滅菌后，貯存于4℃,；（2）葡萄糖可以由NaCl代替,，以利于儲存；但提取大于15kb的質(zhì)粒,，應將細菌懸于等滲蔗糖溶液中,，并用溶菌酶處理；（3）務必使細菌沉淀*分散,，以利于堿液作用充分,；（4）震蕩時可以在離心管中加入牙簽或槍頭，提率,；（5）配制RNaseA貯存液時,，煮沸時間不宜過長或過短；（6）溶液Ｉ每2個月重新配制1次,。
3,、加200μl溶液Ⅱ,，顛倒混勻。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH,，1%SDS
注：（1）若菌體裂解得充分,，則溶液會變得很粘稠；（2）不要劇烈震蕩,，否則會混入基因組DNA,；（3）每2個月重新配制1次。
4,、加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ,，輕微震蕩混勻
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml,，水28.5ml
注：（1）所配成的溶液對鉀是3mol/L,，對乙酸根是5mol/L，pH4.8左右,；（2）盡量不要有大的塊狀沉淀,，以利于下步離心；（3）每1個月重新配制1次,，并分裝貯存于小口瓶中。
5,、12000g離心5分種,，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
6,、加入1/2體積的Tris飽和酚,、1/2體積的氯仿-異戊醇(24:1)混合液，劇烈震蕩混勻,。
7,、12000g離心5分種，將上層液體轉(zhuǎn)移到另一離心管中,。
注：為了保證不吸出下層液體,，可以先離心30秒,，然后將上層與少量下層液體吸至另一離心管,，離心5分種,，再轉(zhuǎn)移上層液體,。切勿混入下層液體。
8、加入60%體積的異丙醇,，顛倒混勻后,，室溫靜置5分鐘,。12000g離心５~10分鐘，小心吸去上清液,。
注：（1）沉淀即為質(zhì)粒DNA,；（2）為確保質(zhì)粒*沉淀,，異丙醇的體積可以適當加大至62~65%,。
9,、0.8ml70%乙醇洗滌DNA沉淀后,，小心地吸去上清。在空氣中靜置3~10分鐘,，待沉淀干燥后,，溶解于50μl高壓滅菌的水中,。
注：為洗滌充分,，可以洗2次,。
10、取1~2μl樣品測定紫外吸光度,，對所得質(zhì)粒進行定量并了解其純度,，或取1~2μl樣品進行瓊脂糖電泳,，估計其純度和得率,。
所得質(zhì)粒不能進行很好的酶促反應的主要原因：1,、細菌收獲時,，培養(yǎng)液沒有吸除干凈,；2,、各種液體放置時間過長,；3,、沉淀中混入痕量酚,、蛋白或過多乙醇；4,、干燥沉淀時,，在空氣中靜置時間過長（數(shù)小時）
質(zhì)粒得率過小的主要原因：1,、細菌培養(yǎng)時間不夠；2,、細菌沉淀重懸于溶液Ｉ時，沒有*分散,；3、加溶液Ⅱ后,，裂解得不充分,；3、各種液體放置時間過長而失效,；4,、加入異丙醇的量不夠；5,、洗滌用的乙醇溶液濃度<60%,；6、嚴緊型質(zhì)粒應適當加大培養(yǎng)體積,，并用氯霉素處理