QQ交談
您所在位置：請輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
采用實(shí)時定量PCR方法對水源中細(xì)菌RNA進(jìn)行定量
最近更新時間：2016-3-23
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：245次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：1542次
定量pcr（Q－PCR）是一種對目的基因定量的快速的方法,。在真核細(xì)胞里,，定量－反轉(zhuǎn)錄－PCR（Q－RT－PCR）也在采用穩(wěn)定表達(dá)的看家基因做參照的情況下用于基因表達(dá)的檢測。在細(xì)菌體內(nèi)，由于不存在穩(wěn)定表達(dá)的看家基因,，因此只有選擇合適的RNA標(biāo)準(zhǔn)品才能對菌體內(nèi)的RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量,。本文建立了一種不僅能定量目的基因拷貝數(shù)（如細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目），還可確定RNA拷貝數(shù)的定量方法,，并用編碼傷寒沙門氏菌invA和16S rRNA的基因來對該方法做出評價(jià),。目的基因的擴(kuò)增片段用來做DNA的標(biāo)準(zhǔn)品，而同樣的DNA標(biāo)準(zhǔn)品在體外轉(zhuǎn)錄用來做合適的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,，接種沙門氏菌的培養(yǎng)基和環(huán)境水樣被用來做zui終的檢測,。結(jié)果表明，運(yùn)用Q－PCR和Q－RT－PCR法均能對目的基因和RNA分子進(jìn)行靈敏,、,、高重復(fù)性的定量。這是RNA標(biāo)準(zhǔn)被運(yùn)用到原核生物的定量,，表明這是一種對環(huán)境樣品致病菌的存在性和代謝活性分析的新型檢測方法,。
前 言
水源中病源微生物的存在情況與人類健康息息相關(guān)（21，28）,。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測方法不僅耗時,，而且無法確定細(xì)菌的存活情況；PCR方法的應(yīng)用便使上述問題得到了解決,，并由此發(fā)展出多種針對水體病源微生物的檢測方法（7,，9，13）,。但由于DNA在病原體死亡后還有很長的存在期,，由此會造成假陽性的結(jié)果，因而在確立鑒定目的基因存在與否就代表細(xì)菌存在與否這個問題上就出現(xiàn)了爭議（6）,。因此,，監(jiān)測相對不穩(wěn)定的RNA樣本就成了另一個更為有效的方法（20）。
實(shí)時定量PCR（Q－PCR）和反轉(zhuǎn)錄PCR（Q－RT－PCR）可以對基因,、基因產(chǎn)物,、甚至環(huán)境樣品進(jìn)行有效定量（16，24）,。然而，由于缺乏可靠的參照,，RNA定量的發(fā)展受到了局限,。在真核細(xì)胞內(nèi)，穩(wěn)定表達(dá)的看家基因（如β-actin）可用作基因表達(dá)的相對定量的標(biāo)準(zhǔn),。遺憾的是,，在細(xì)菌體內(nèi)，還沒有發(fā)現(xiàn)上述可穩(wěn)定表達(dá)的基因。一部分人認(rèn)為,，可以選取16SrRNA的總量作為功能性基因表達(dá)的參照（12,，14）。然而,，rRNA的表達(dá)是和細(xì)菌的生理狀態(tài)相關(guān)的（5,，18）。當(dāng)我們檢測一系列環(huán)境樣品的基因表達(dá)情況時,，細(xì)菌的生理狀態(tài)（如每個細(xì)胞16SrRNA的表達(dá)水平）是*未知的,。并且，這種方法無法對目的基因拷貝數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量,。另一部分人則認(rèn)為,，可采用基因組DNA或包含基因組DNA片斷的質(zhì)粒作Q－RT－PCR的參照（17，22,，23）,。
然而，使用DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品沒有考慮到在反轉(zhuǎn)錄這一步中反轉(zhuǎn)錄效率的問題,，而這一步會導(dǎo)致反應(yīng)的效率與真實(shí)值相比會降低了84%-98.6%,。因此，采用DNA作參照標(biāo)準(zhǔn)往往會低估實(shí)際的靶分子含量,。真核細(xì)胞可采用細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的RNA作參照避免上述的情況,，而細(xì)菌也需要找到一種類似的方法去解決這個問題。
我們研究的目的就是為了尋找一種能對環(huán)境水樣中病菌基因和RNA樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量的分析方法,。以沙門氏菌為模式生物,，將invA和16SrRNA的編碼基因作為目標(biāo)基因，并采用在無菌的培養(yǎng)基或水樣中接種進(jìn)行驗(yàn)證,。結(jié)果表明,，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)品能成功地用于細(xì)菌內(nèi)RNA的拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量。這種以Q－PCR為基礎(chǔ)的方法便能夠?qū)Νh(huán)境水樣中病原體微生物的存在及代謝活動做出靈敏而準(zhǔn)確的評估,。
表1. DNA和RNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Q－PCR的對應(yīng)引物
采用實(shí)時定量PCR方法對水源中細(xì)菌RNA進(jìn)行定量
a T7啟動子的相應(yīng)序列用下劃線標(biāo)識,，b 存在于基因的具體位置用數(shù)字范圍表示