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PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析及對(duì)策
最近更新時(shí)間：2016-1-13
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
文件類(lèi)型：PNG 圖片下載次數(shù)：148次
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問(wèn)題1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物
現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)
原因:
1.模板:含有抑制物,，含量低
2.Buffer對(duì)樣品不合適
3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解
4.反應(yīng)條件：退火溫度太高,，延伸時(shí)間太短
對(duì)策:
1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更換Buffer或調(diào)整濃度
3.重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物
4.降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間
PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析及對(duì)策(無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,、非特異性擴(kuò)增,、拖尾、假陽(yáng)
問(wèn)題2：非特異性擴(kuò)增
PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析及對(duì)策(無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,、非特異性擴(kuò)增,、拖尾、假陽(yáng)現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶
原因：
1.引物特異性差
2.模板或引物濃度過(guò)高
3.酶量過(guò)多
4.Mg2+濃度偏高
5.退火溫度偏低
6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多
對(duì)策：
1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR
2.適當(dāng)降低模板或引物濃度
3.適當(dāng)減少酶量
4.降低鎂離子濃度
5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法
6.減少循環(huán)次數(shù)
問(wèn)題3：拖尾
PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析及對(duì)策(無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,、非特異性擴(kuò)增,、拖尾、假陽(yáng)現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài),。
原因：
1.模板不純
2.Buffer不合適
3.退火溫度偏低
4.酶量過(guò)多
5.dNTP,、Mg 2+濃度偏高
6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多
對(duì)策：
1.純化模板
2.更換Buffer
3.適當(dāng)提高退火溫度
4.適量用酶
5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度
6.減少循環(huán)次數(shù)
問(wèn)題4：假陽(yáng)性
現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物
原因：
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物
的交*污染
對(duì)策：
1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外,；
2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管
及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用,。
3.各種試劑先進(jìn)行分裝,，然后低溫貯存