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實時定量PCR應(yīng)用中的問題和優(yōu)化方案
最近更新時間：2015-12-14
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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction , PCR）自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感,、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進(jìn)行定量的有力工具[1],。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展,，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，不僅建立了一系列的方法,，而且也誕生了許多與這些方法相匹配的新型熱循環(huán)儀和實驗材料,。實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種具有革命性意義的定量PCR技術(shù)，所謂實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測 熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量,，并據(jù)此推斷目的基因的初始量[2],。目前它作為一個極有效的實驗方法,，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，僅2000-2001年,，收錄在Medline上的以Real-Time PCR為關(guān)鍵詞的文章就達(dá)一千多篇,。實時PCR技術(shù)較之與以前的以終點法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有的優(yōu)勢。首先,，它不僅操作簡便,、快速，而且具有很高的敏感性和特異性,。其次,，由于是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作,。另外,，它還可以通過不同的引物設(shè)計在同一反應(yīng)體系中同時對多個靶基因分子進(jìn)行擴(kuò)增，即多重擴(kuò)增[3,4,5],。本文將對實時定量PCR目前的應(yīng)用狀況,、儀器應(yīng)用、新材料進(jìn)展以及實驗條件的優(yōu)化作一綜述,。
實時定量pcr的應(yīng)用現(xiàn)狀
實時定量PCR技術(shù)自1996年誕生以來,，由于它顯著的*性，不僅廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個研究領(lǐng)域,，而且也開始作為一種診斷手段應(yīng)用于臨床,。其應(yīng)用涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量,，核酸多態(tài)性分析,，基因突變分析等多個領(lǐng)域[3]。
Giulietti 等人[6]對用實時定量PCR測定細(xì)胞因子基因的表達(dá)作了詳細(xì)的描述,。細(xì)胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白,，它對免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,，其量的改變常常與一些疾病,，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病,、移植排斥有密切的關(guān)系,。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質(zhì)水平的檢測，另外,，通常用的蛋白質(zhì)檢測方法（如elisa）的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測,，所以應(yīng)用PCR定量進(jìn)行基因診斷就顯得十分有意義。
*,，cDNA微排列和差異表達(dá)PCR技術(shù)是對基因表達(dá)變化分析的兩種關(guān)鍵技術(shù),，但是這兩種技術(shù)只能對基因表達(dá)變化進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析,。Rajeevan等人[7]利用實時定量PCR技術(shù)卻成功地將基因表達(dá)的變化進(jìn)行了量化,，不僅有效地證明了上述兩種方法的有效性，而且提供了一種具有高通量的對基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測的新技術(shù),。
實時定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)不僅增強(qiáng)了有關(guān)對基因量變化的研究方法,，而且也增強(qiáng)了對基因質(zhì)所發(fā)生變化方面的研究。例如Laird和他的同事們[8]建立了一種被稱作Methylight的實時定量PCR方法,，它能通過特異的引物和/或Taqman探針檢測基因CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生了甲基化,。由于實時PCR的敏感性和特異性，使得這種方法對胞嘧啶的過度甲基化常常具有*的靈敏度,。zui近有研究表明這種方法可以從食管癌病人的食管粘膜中檢出含有發(fā)生了過度甲基化基因的細(xì)胞[9],。又如Sevall等人[10]證明可以用實時定量PCR方法區(qū)分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報告基團(tuán)標(biāo)記Taqman探針,，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發(fā)生雜交,，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交決定的，所以如果出現(xiàn)一種信號強(qiáng)于另一種信號則表明兩條基因具有同源性,，若兩種信號都增強(qiáng)則表明為異源性,。
目前實時定量PCR在臨床診斷方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在對感染組織或細(xì)胞負(fù)載病毒的定量測定上，這一技術(shù)對DNA和RNA病毒都可以檢測,，目前已有標(biāo)準(zhǔn)的操作手冊供人們使用,，但是必須明確，上既沒有統(tǒng)一的病毒荷載的標(biāo)準(zhǔn),，也存在著對其標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量準(zhǔn)確性的各種爭論,。這里值得一提的是一種稱為NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技術(shù)[11]，它是一種利用電化學(xué)以光的等溫pcr反應(yīng),，在反應(yīng)過程中能產(chǎn)生一種與靶RNA反極性的RNA擴(kuò)增子,，分子beacon常用于這種技術(shù) ，這種方法常常用于對逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量測定,。
常用的熱循環(huán)儀
對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時定量的測定之所以能成為現(xiàn)實,，并且應(yīng)用如此廣泛，其中一個重要的原因就是新的熱循環(huán)儀的研制與推廣,。目前,，國內(nèi)外常用的熱循環(huán)儀主要有以下幾種：
1. PE公司生產(chǎn)的Applied Biosystem系列：(1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是*種作為商業(yè)用途的實時PCR測定儀，它由激光激發(fā)熒光,，并且可在500-660nm范圍內(nèi)調(diào)節(jié)波長,，可以用于基于水解探針、雙鏈DNA結(jié)合染料,、分子beacon原理的分析,。一次可以測定96個樣本,，并且速度較快，一批樣本的完成只耍要2小時,。但是它不能實時對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析,，而只能在全部擴(kuò)增結(jié)束后才進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作與 ABI Prism 7700 SDS相同,，但是它是利用鹵素?zé)魹榧ぐl(fā)光源,，而且只設(shè)計了一個檢測波長。(3) ABI Prism 7900 SDS: 這是一種為實現(xiàn)高通量檢測而設(shè)計的儀器,，其基本構(gòu)成與ABI Prism 7700 SDS相同,，但程序設(shè)計*實現(xiàn)自動化要求，而且有兩種樣品盤可供選擇（96孔和384孔）,。如果加上一個裝載輔件,，可以在24h之內(nèi)完成84個384孔板的樣本測定。